作者：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（張全勝，通訊作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（煙臺大學(xué)海洋學(xué)院）

時(shí)間：2019年7月25日

期刊：Photosynthesis Research

英文標題：The highly efficient NDH?dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina

關(guān)鍵字：環(huán)式電子傳遞、NADPH脫氫酶復合體、放氧復合體、跨膜質(zhì)子梯度、大葉藻

過(guò)量輻射引起的光合器官的光氧化損傷是影響陸生和海生植物的主要脅迫因子之一。光氧化損傷會(huì )破壞ATP和NADPH產(chǎn)生的化學(xué)計量平衡，植物必須對ATP和NADPH進(jìn)行非常精確的動(dòng)態(tài)控制，以維持高效的光合作用，滿(mǎn)足植物不同的代謝需求。通過(guò)調整線(xiàn)性電子(LEF)到光系統I循環(huán)電子 (PSI-CEF)的速率，ATP /NADPH比值可以被靈活地調整到所需的水平。當由兩個(gè)光系統驅動(dòng)的LEF從水到NADP+時(shí)，O2在氧進(jìn)化復合體(OEC)發(fā)生進(jìn)化，同時(shí)產(chǎn)生NADPH和ATP。作為一種補充機制，PSI-CEF催化電子從PSI受體轉移到質(zhì)體醌(PQ)，使光化學(xué)激發(fā)的電子通過(guò)cytb6f復合物和PC返回到PSI，而不需要凈生成任何基質(zhì)還原劑。在這個(gè)過(guò)程中，質(zhì)子被從基質(zhì)中取出并泵入到類(lèi)囊體腔，產(chǎn)生了跨類(lèi)囊體的質(zhì)子梯度(△pH)，并通過(guò)CF0F1-ATP合酶通道驅動(dòng)ATP合成。因此，PSI-CEF的活性被認為有助于平衡由光反應產(chǎn)生的ATP/NADPH的比例。

在被子植物中至少提出了兩種備選的PSI-CEF通路。主要途徑是涉及質(zhì)子梯度調節5 (PGR5)和類(lèi)PGR5光合顯型1 (PGRL1)的抗霉素a敏感途徑。次要途徑是由對魚(yú)藤酮敏感的葉綠體NADPH脫氫樣(NDH)復合物介導的。擬南芥突變體實(shí)驗發(fā)現PGR5/L1和NDH依賴(lài)的循環(huán)電子傳遞對跨類(lèi)囊體膜質(zhì)子梯度分別貢獻30%和5%。葉綠體NDH復合體是位于類(lèi)囊體基質(zhì)中的一種多蛋白復合體，最初是通過(guò)與線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞中的復合體I同源而發(fā)現的。迄今為止，在葉綠體NDH復合體中共檢測到29個(gè)亞基，其中包括五個(gè)亞復合體:膜亞復合體、亞復合體A、亞復合體B、腔內亞復合體和電子供體結合亞復合體。葉綠體NDH復合體缺乏氧化NAD(P)H的亞基，但有與Fd位點(diǎn)鏈接的供體連接亞復合體，NAD(P)H將電子經(jīng)Fd傳遞給NDH復合體繼而還原PQ庫。

目前提出了依賴(lài)NDH的PSI-CEF的三個(gè)主要功能：(1)通過(guò)下調通過(guò)cytb6/f復合物的電子輸運以酸化類(lèi)囊體腔來(lái)啟動(dòng)光保護，并在PSII中誘導非光化學(xué)猝滅的qE組分來(lái)消散吸收的多余光能；(2)在各種嚴重脅迫條件下，通過(guò)保持ATP/NADPH的高輸出比來(lái)保護光合器官免受基質(zhì)過(guò)度還原的傷害；(3)產(chǎn)生額外的ATP來(lái)驅動(dòng)蛋白質(zhì)修復，滿(mǎn)足植物的各種代謝需求。然而，葉綠體NDH復合體的生理功能可能因物種、處理條件、生長(cháng)環(huán)境等有所不同。已有研究表明，NDH依賴(lài)的PSI-CEF損傷不影響整體光合作用，說(shuō)明NDH依賴(lài)的PSI-CEF在穩態(tài)光合作用中不是必需的，雖然它在波動(dòng)環(huán)境下的光合調節中發(fā)揮作用。一般認為NDH依賴(lài)的PSI-CEF不參與弱光條件下的光合作用，但最近的一項研究表明，水稻的NDH復合體缺失可以在弱光條件下降低碳同化速率和植物生物量積累。絕大多數的海洋植物(Peltier和Cournac 2002)，以及一些陸生高等植物，如所有種類(lèi)的球根植物和松科植物，以及部分種類(lèi)的蘭科和天竺葵科植物，均未檢測到NDH基因編碼。缺乏NDH復合體，表明該復合體的功能可有可無(wú)，可能存在一些替代或補償的電子傳遞途徑彌補其功能。相反，NDH復合體在某些物種中的存在可能提供一個(gè)關(guān)鍵的選擇優(yōu)勢，使光合反應能夠適應環(huán)境壓力。大多數海洋植物的NDH復合體的缺失可能與它們相對穩定的海洋棲息地有關(guān)。

大葉藻屬(Zostera marina, Zosteraceae)，又稱(chēng)eelgrass，是一種廣泛分布的海草物種，由陸地單角類(lèi)的淡水祖先進(jìn)化而來(lái)，并成功地過(guò)渡到完全淹沒(méi)的海洋分類(lèi)單元。在進(jìn)化過(guò)程中，基因組的缺失和擴增現象頻繁發(fā)生，為其海洋生活方式所需的結構和生理適應提供了遺傳變異。根據氨基酸序列的多重比對，發(fā)現大葉藻具有完整的29個(gè)編碼葉綠體NDH亞基的基因，即使在海洋被子植物中也很少見(jiàn)。分類(lèi)與大葉藻同目的波喜蕩草屬（Posidonia）和根枝草屬（Amphibolis）未檢測到編碼葉綠體NDH復合體的基因。因此，葉綠體NDH復合體在Z. marina的作用需要探索。在本文中，我們提出了在Z. marina中高效的NDH依賴(lài)的PSI-CEF，這可能與OEC失活以及光合性能的維持有關(guān)。此外，我們提供的證據表明，在過(guò)量輻照下依賴(lài)NDH和依賴(lài)PGR5/Li的PSI-CEF之間存在此消彼長(cháng)的動(dòng)態(tài)變化。

—— 材料和方法 ——

植物材料

在位于中國山東半島北側的榮成(37°16′N(xiāo), 122°41′E)3 m深度的次潮汐海草床上采集到根莖系統完整(6-9節間)的健康大葉藻。在2019年5月連續幾天的下午晚些時(shí)候進(jìn)行采樣。大葉藻在實(shí)驗前在過(guò)濾海水水族館預培養3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期進(jìn)行照明。根據最小飽和光強度，照明由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。從葉鞘上方2厘米處采集葉片進(jìn)行實(shí)驗測量，以保持相同的年齡。

進(jìn)化分析

基于29個(gè)NDH亞單位的串聯(lián)序列，采用MEGA 5.0程序構建系統發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行了1000次重復的bootstrap測試。這30個(gè)物種的所有這些序列都是通過(guò)BLASTP分析從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索到的。交互式生命樹(shù)(https:// url .embl.de/)用于對樹(shù)進(jìn)行注釋和修飾。

光處理和抑制劑處理

暗適應過(guò)夜的大葉藻暴露在三種不同的光強度，50,300和600μmolm-2s - 1反應3小時(shí)。這些處理在下文稱(chēng)為弱光（LL）、中光（ML）和強光（HL），它們通過(guò)德國DUAL-PAM-100來(lái)測量最小飽和光強來(lái)確定。所有處理均在光照培養箱(GZP-250N，上海森欣實(shí)驗儀器有限公司)中進(jìn)行，控制海水溫度為15℃，模擬其在自然環(huán)境中的生長(cháng)狀態(tài)。光由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。在測定熒光動(dòng)力學(xué)之前，隨機選取暴露于光照下的葉片，每隔20分鐘至暗適應15分鐘。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分別用于抑制PGR5/L1和NDH依賴(lài)的PSI-CEF。分別以甲醇和二甲亞砜為溶劑，制備了AA和魚(yú)藤酮原液。處理后樣品的溶劑濃度低于1% (v/v)。葉片使用過(guò)濾海水或含1μM AA, 150μM魚(yú)藤酮的海水進(jìn)行飽和，并在光處理之前，在15℃的黑暗條件下孵育葉片1 h。

葉綠素A熒光和P700測定

利用DUAL-PAM-100測量系統同時(shí)測量葉綠素a熒光和P700+吸光度變化。在微弱的調制光下（5μmol m-2s-1）測量出最小熒光值（Fo）后，分別對暗適應和光適應條件下的葉片在300ms的飽和脈沖光下（16000μmol m-2 s-1）測量Fm和Fm’。Fs是光照條件下的穩態(tài)熒光值。P700+的信號會(huì )在最?。ㄍ耆€原）和最大（完全氧化）之間變化。最大的變化在P700完全氧化狀態(tài)(Pm)和一個(gè)給定的光狀態(tài)(Pm’)是在遠紅光(250μmol m? 2 s?1)和光化光（127μmol m? 2 s?1）預照射后由飽和脈沖光測量。PSII的最大光量子產(chǎn)量：Fv/Fm = (Fm ? Fo)/Fm，PSII的電子傳遞速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的電子傳遞速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。

暗適應樣品在光化光下照射2min，在關(guān)閉AL后，我們監測了隨后葉綠素熒光的瞬時(shí)增加作為NDH活性的一個(gè)指標，關(guān)閉AL后10 s內測定鼓包的初始斜率。根據Li等人的方法，在暗適應葉片中，當光誘導吸光度在830nm處發(fā)生變化時(shí)，監測P700+的還原動(dòng)力學(xué)。我們測量P700的再次還原之前采用一個(gè)專(zhuān)用校準程序對P700信號進(jìn)行歸一化處理。遠紅光照射后10 s內測定P700+再還原半衰期縮短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。

快速OJIP熒光瞬態(tài)測量

利用多功能植物效率分析法測定葉綠素熒光快速誘導曲線(xiàn)。由曲線(xiàn)得到如下數據：20 μs的最小熒光值（Fo），最大熒光值（Fm），0.3ms的熒光值（K-step，Fk），3ms的熒光值（J-step，Fj），30ms的熒光值（I-step，Fi）。為了評價(jià)PSII的活性，計算了PSII從光子吸收到系統間電子受體減少的能量守恒性能指數(勢)：PIABS=4 ×(Fk ? Fo) × Fm × (Fm ? FJ)/Fv × (FJ ? Fo)2，作為PSII供體側指標監測的k步歸一化可變熒光被計算為WK = (Fk?Fo)/(FJ?Fo)。

ECS分析

電致變色效應吸光度信號變化的測量是用DUAL-PAM-100的P515/535模塊在515nm波長(cháng)下進(jìn)行監測。樣品先暗適應15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再進(jìn)行測量。AL被關(guān)閉，記錄ECS的衰變動(dòng)力學(xué)，以確定總ECS，代表了總質(zhì)子動(dòng)能(pmf)的大小及其組成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰減(gH+)是通過(guò)最初的300ms響應速率到P515發(fā)射結束來(lái)估計的。

免疫印跡分析

從處理的葉片中分離出葉綠體按照是廠(chǎng)家的指導使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit測量。葉綠素含量測定采用Porra等人的方法。根據Towbin等人的描述，對NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗體進(jìn)行Westernblot分析。采用Rubisco大亞單位抗體(RbcL, Agrisera，瑞典)作為內參對照。用凝膠對x射線(xiàn)膠片上產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光帶進(jìn)行密度測量使用圖像實(shí)驗室軟件對Doc XR+系統(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進(jìn)行量化。每個(gè)目標條帶的總密度都是基于RbcL密度進(jìn)行標準化的。

數據分析

采用SPSS 22.0統計軟件包進(jìn)行統計分析。所有參數均采用單因素方差分析。采用Tukey趨勢檢驗進(jìn)行事后比較。差異有統計學(xué)意義P < 0.05。使用Origin9.0程序，采用單指數函數擬合法對P700+再還原的每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合。使用線(xiàn)性回歸分析來(lái)評估WK，PIABS，和鼓包。

—— 結果 ——

NDH復合體的系統發(fā)生分析

基于連接的29個(gè)NDH亞基序列構建了葉綠體NDH復合體的系統發(fā)生樹(shù)，顯示了NDH復合序列在藍藻、苔蘚、蕨類(lèi)、蕨類(lèi)和石生植物中NDH復合體的系統發(fā)育關(guān)系。在藍藻門(mén)，輪藻門(mén)和蕨類(lèi)植物NDH復合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亞基的。Z.marina包含五個(gè)完整的NDH亞復合物。海洋植物中除了原始藻類(lèi)之外，綠藻、硅藻、紅藻和褐藻等常見(jiàn)藻類(lèi)都缺少編碼葉綠體NDH復合體亞基的同源基因，這表明Z. marina中NDH復合體的存在可能在光合作用中發(fā)揮重要作用。

圖1 葉綠體NDH復合體的系統發(fā)生樹(shù)

PSI循環(huán)電子流的動(dòng)態(tài)變化

以ETRI-ERTII為代表的PSI-CEF的活性在三個(gè)水平的照射下逐漸增加。同樣，P700+再誘導所示的PSI-CEF活性也隨著(zhù)光強的升高而逐漸升高。這些結果表明，大葉藻PSI-CEF隨著(zhù)光照時(shí)間的延長(cháng)逐漸增強，同時(shí)也會(huì )隨著(zhù)光照強度的增強而增強。

圖2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理條件下ETRI-ETRII隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨立樣本計算。采用Tukey趨勢檢驗，差異有統計學(xué)意義(P < 0.05)

圖3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理條件下P700+再還原半衰期隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨立樣本計算。每個(gè)點(diǎn)表示對指數函數的擬合（所有R2值＞0.96）

兩個(gè)PSI循環(huán)電子途徑的動(dòng)態(tài)變化

利用光照后葉綠素熒光的瞬時(shí)增強來(lái)測定NDH依賴(lài)的PSI-CEF。如圖4a所示，葉綠素熒光在光照后出現了明顯的瞬時(shí)增強，且這種增強在HL條件下大于ML大于LL光照處理。此外，光照后的初始斜率隨著(zhù)曝光時(shí)間的增加而逐漸增大(圖4c)，說(shuō)明NDH依賴(lài)的PSI-CEF被顯著(zhù)激活。為了確定處理過(guò)量照射的兩個(gè)PSI-CEF通路的持續響應，我們使用從Z. marina葉子中分離的葉綠體，使用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。針對NdhH亞基的抗體只能識別45kDa的一個(gè)多肽，而抗NdhS的抗體只能識別27-kda的一個(gè)蛋白。每個(gè)樣本中，anti-PGR5識別一個(gè)15-kda蛋白，anti-PGRL1識別一個(gè)29-kda蛋白（圖5）。光密度分析顯示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依賴(lài)通路活性明顯隨暴露時(shí)間的延長(cháng)而逐漸增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表達的PGR5/L1相關(guān)的通路活性在光照開(kāi)始后的早期最高，隨后下降到穩定水平(圖5b)，表明PGR5 /l1依賴(lài)和nndh依賴(lài)的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

圖4 a一種監測NDH活性的經(jīng)典葉綠素熒光追蹤，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下照射3h后鼓包的響應。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下鼓包的初始斜率隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨立樣本計算。采用T檢驗，差異有統計學(xué)意義(P < 0.05)