甜菜孢囊線(xiàn)蟲(chóng)（Heterodera schachtii）是全世界重要的檢疫性有害生物，對甜菜具有毀滅性危害。1850 年德國首次報道該線(xiàn)蟲(chóng)(Franklin ＆ Heterodera, 1972) 。到目前為止，該線(xiàn)蟲(chóng)已在全世界的美洲、歐洲、亞洲等50多個(gè)國家或地區有分布，20多個(gè)國家將該線(xiàn)蟲(chóng)列為檢疫對象(Steele, 1984) 。甜菜孢囊線(xiàn)蟲(chóng)是甜菜上危害最嚴重的病原生物之一，可導致甜菜產(chǎn)量損失25%～50%，每年造成超過(guò)150億美元的經(jīng)濟損失 (Singh et al., 2015)。篩選土壤樣本以定性和定量地評估線(xiàn)蟲(chóng)感染是一項預防措施，也是農業(yè)害蟲(chóng)管理策略的一個(gè)組成部分。
甜菜孢囊線(xiàn)蟲(chóng)以卵的形式在土壤中可以存活多年，孢囊是由雌性線(xiàn)蟲(chóng)的遺骸形成的保護性外殼。雌性線(xiàn)蟲(chóng)死亡后，其體壁變硬，形成棕色的硬化孢囊。量化線(xiàn)蟲(chóng)感染的能力是針對線(xiàn)蟲(chóng)的控制措施以及開(kāi)發(fā)抗線(xiàn)蟲(chóng)植物育種系的先決條件?？梢酝ㄟ^(guò)孢囊計數來(lái)估計線(xiàn)蟲(chóng)種群密度。孢囊需要從含有有機碎片的土壤樣品中手工挑選，其中碎片的數量取決于樣品提取方法。手動(dòng)計數是一項耗時(shí)的任務(wù)，計數準確性受到主觀(guān)決策、持續專(zhuān)注的能力以及將孢囊與其他顆粒分離的經(jīng)驗的影響。因此，只有自動(dòng)計數才適用于高通量應用。雖然線(xiàn)蟲(chóng)的數量是一項重要的定量衡量標準，但表型特征（例如孢囊的大小、形狀和顏色）也是相關(guān)的。研究顯示，孢囊大小的增加是馬鈴薯孢囊線(xiàn)蟲(chóng)種群適應植物抗性的指標（Fournet et al., 2016），這表明孢囊表型與抗性相關(guān)。雖然其他數據模式，例如遺傳數據，也可以應用于估計線(xiàn)蟲(chóng)感染（Bogale et al., 2020），但只有圖像數據可用于表征孢囊的表型。
本文介紹了一種基于計算機視覺(jué)的高通量系統，該系統可以量化甜菜孢囊線(xiàn)蟲(chóng)感染并測量孢囊的表型特征。在標準化環(huán)境中記錄土壤樣本提取物的顯微圖像后，實(shí)例分割算法用于檢測這些圖像中的線(xiàn)蟲(chóng)孢囊。在一項使用已知孢囊數量的真實(shí)樣本和人工注釋圖像的評估中，計算機視覺(jué)方法產(chǎn)生了準確的線(xiàn)蟲(chóng)孢囊計數以及準確的孢囊分割?；谶@樣的分割，可以計算出孢囊特征，以揭示不同土壤中線(xiàn)蟲(chóng)種群之間的表型差異，以及甜菜種植前后觀(guān)察到的種群。計算機視覺(jué)方法不僅能夠快速準確地計數孢囊，而且能夠在不同條件下對孢囊特征進(jìn)行表型分析，為農業(yè)和植物育種研究中的高通量應用提供了基礎。源代碼和帶注釋的圖像數據集可供科學(xué)使用，通過(guò)額外的訓練數據，該系統也可以推廣到其他線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)。
土壤樣本取自已知具有甜菜孢囊線(xiàn)蟲(chóng)感染歷史的土地。通過(guò)網(wǎng)篩組合（2 mm和100 μm）制備用于圖像采集的土壤提取物。隨后，通過(guò)離心浮選技術(shù)從篩選的土壤提取物中提取孢囊。將孢囊與剩余的有機物部分一起收集在白色濾紙上，以備成像使用。樣品圖像由德國LemnaTec提供的PhenoAIxpert HM記錄（圖S1）。它由一個(gè)工業(yè)RGB相機和高倍物鏡系統組成。該系統安裝在物體上方 35 cm處，視野為 35 × 25 mm。圍繞樣品臺布置的水平定向LED（4000 K）作為照明光源。所有組件都安裝在不透明的機柜內，以保護它們免受外部光線(xiàn)的影響。在PhenoAIxpert HM原型機中，樣品臺由一個(gè)樣品架組成，該樣品架可以手動(dòng)移動(dòng)到預定義的位置，以便執行樣品的一系列成像。圖像采集由控制計算機手動(dòng)觸發(fā)。將來(lái)，樣品臺將被電動(dòng)X(jué)-Y工作臺取代，然后自動(dòng)將樣品移動(dòng)到預定義位置并以同步方式觸發(fā)圖像采集。
圖S1 PhenoAIxpert HM將由德國LemnaTec作為商業(yè)產(chǎn)品推出（HM：High Magnification）
圖1 用于線(xiàn)蟲(chóng)孢囊分割的計算機視覺(jué)流程
表1 用于孢囊計數驗證的樣本
圖2 手動(dòng)孢囊計數與自動(dòng)孢囊計數的比較
在所有土壤樣本類(lèi)型中，手動(dòng)孢囊計數與自動(dòng)孢囊計數相似（圖2A），無(wú)論孢囊與有機碎片混合（“碎屑”）還是孢囊與有機碎片分離（“干凈”）。手動(dòng)計數和自動(dòng)計數相關(guān)性的皮爾遜相關(guān)系數很高，“干凈”為0.981，“碎屑”為0.975（圖2B），表明使用自動(dòng)方法可以可靠地估計孢囊的相對數量。
圖3 手動(dòng)孢囊分割與自動(dòng)孢囊分割的比較
圖4 線(xiàn)蟲(chóng)孢囊表型特征的分布（孢囊大小和長(cháng)寬比）
—— 原文 ——
Chen L, Daub M, Luigs HG, et al. High-throughput phenotyping of nematode cysts. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 965254.
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