提起光合作用測量?jì)x器，
可能很多人都會(huì )搶答，
這個(gè)我知道，光合儀和熒光儀嘛！
那我再問(wèn)，光合儀和熒光儀具體都測什么？
如何選擇？哪個(gè)更好用？
突然好多概念，參數浮現在腦海，
我們好像在哪見(jiàn)過(guò)！
OK！坐好，手背后邊，
睜大眼睛，豎起耳朵，
聽(tīng)小編來(lái)給你們“瞎扯”一番。
—— 光合作用的光&合 ——
Photosynthesis=Photon（光）+Synthesis（合），光合作用可分為光反應和暗反應。
光反應：發(fā)生葉綠體的類(lèi)囊體膜上，以光能捕獲傳遞轉化為基礎的光能利用，氧氣釋放和電子傳遞。
暗反應：發(fā)生在葉綠體基質(zhì)內，以CO2吸收同化合成為基礎的酶促反應，羧化，還原，再生。
>> 總結 <<
光反應：反應相對快，光子轉化成電子實(shí)現太陽(yáng)能的初級利用。涉及到光能轉換效率，激發(fā)能耗散途徑，電子傳遞速率，NADPH和ATP合成。
暗反應：反應相對慢，吸收CO2，通過(guò)酶促反應利用光反應產(chǎn)生的還原劑，合成糖類(lèi)，淀粉，實(shí)現活躍化學(xué)能到穩定化學(xué)能的轉化。涉及氣孔導度，葉肉導度，蒸騰速率，羧化效率。
—— 光反應和暗反應的測量?jì)x器 ——
光合儀：氣體交換原理，利用紅外氣體分析器（InfraRed Gas Analyzer IRGA）測量流經(jīng)葉片前后CO2和H2O的濃度變化，分析葉片與環(huán)境發(fā)生的氣體交換，用固定了多少CO2來(lái)表征光合作用的能力。常用的參數是凈光合速率，蒸騰速率，氣孔導度，胞間二氧化碳濃度等。氣體交換是非常經(jīng)典的光合作用測量方法，光合儀是常被用來(lái)測量氣體交換的儀器。
熒光儀：葉綠素熒光原理，通過(guò)檢測光合作用光能利用過(guò)程中葉綠素熒光的產(chǎn)量(F)，來(lái)分析光合作用光能吸收，轉化和分配。用葉綠素熒光參數來(lái)表征不同途徑能量分配的多少。常用的參數有光系統的最大光能轉換效率(Fv/Fm), 實(shí)際光能轉換效率(Yield), 光化學(xué)淬滅(qP), 非光化學(xué)淬滅(NPQ), 電子傳遞速率（ETR）等。葉綠素熒光法具有無(wú)損，原位測量等優(yōu)勢，可以作為光合作用的有效探針，葉綠素熒光儀廣泛應用于實(shí)驗室和野外光合作用研究。
>> 總結 <<
光合作用和蒸騰作用相伴發(fā)生，光合儀測量葉片和環(huán)境的氣體交換。交換的氣體是H2O和CO2，交換的門(mén)戶(hù)是氣孔，交換的結果是水分從葉片中蒸騰散失，CO2進(jìn)入葉片被同化。光合儀測量光合作用極易受到環(huán)境濕度，CO2濃度，光照，溫度的影響，測量過(guò)程中應盡量保持環(huán)境條件穩定。
光能的吸收與耗散平衡，熒光儀測量吸收光能中用于發(fā)射熒光的部分，根據模型計算轉化為光合電子傳遞和熱耗散的部分。熒光儀測量的葉綠素熒光通常指的是室溫（25℃）葉綠素熒光，熒光儀測量光合作用主要受光照強度（PAR）和溫度的影響。
—— 如何選擇或哪個(gè)更好用？——
任何一種儀器的選擇，
都要服從科研內容對工具的需求！
舉個(gè)例子，一個(gè)種質(zhì)資源管理中心，如果要收集200個(gè)水稻品種的田間光合特性數據，可以嘗試使用熒光儀測量實(shí)際光能轉化效率即可，熒光儀可以在短時(shí)間內測量大量樣品。換一個(gè)角度，如果是要評估改良的新品種和親本之間的光合差異，則建議使用光合儀來(lái)測量，畢竟固定CO2生成糖和淀粉才是作物產(chǎn)量的保證。你品，你細品！
光合儀和熒光儀可以獨立存在，但是光反應和暗反應不會(huì )獨立運行。所以，兩者沒(méi)有絕對意義上的高下，因為光反應和暗反應同樣重要。如果想全面的分析光合作用，光合儀和熒光儀都需要用到，最佳的使用方案是聯(lián)用，同步測量氣體交換和葉綠素熒光。
—— 使用光合儀和熒光儀要注意什么？——
>> 光合儀 <<
1、預熱！預熱！預熱！所有IRGA原理的光合儀都需要預熱！不同品牌的光合儀預熱時(shí)間不同，實(shí)際應用中預熱的時(shí)間約為30-60分鐘。
2、分析器調零，調零的目的是為了消除光合儀的檢測誤差。不同品牌，不同型號的光合儀，根據IRGA類(lèi)型的不同，調零模式有差異。目前比較常見(jiàn)的是雙通道四分析器光合儀，雙通道是Reference和Sample兩股氣路通道，四分析器分別是H2O Reference分析器和CO2 Reference分析器，H2O Sample分析器和CO2 Sample分析器。在測量葉片前先測量分析器的讀數差異并將其固定即視為調零，之后才可以進(jìn)行氣體交換的測量。
調零氣路
測量氣路
3、精確控制環(huán)境因子（光、溫、水、氣），光合儀主要采用開(kāi)放式氣路系統，即光合儀從環(huán)境中吸取空氣，測量流經(jīng)葉片前后CO2和H2O的濃度變化，測量后的氣體從出氣口流走。環(huán)境空氣的溫度，濕度，CO2濃度及環(huán)境的光強劇烈波動(dòng)會(huì )嚴重影響光合儀的使用。因此建議在使用過(guò)程中精確控制環(huán)境因子。
4、原位測量，嚴禁離體，因為離體葉片生理狀態(tài)會(huì )發(fā)生變化，最明顯的就是氣孔關(guān)閉。除了離體損傷之外，可能會(huì )導致氣孔關(guān)閉的還有手上的汗液或化妝品殘留等，所以不要直接用手擦拭葉片。
5、葉片面積（或重量），光合儀計算的光合速率是單位面積（或重量），單位時(shí)間內的CO2同化率，測量時(shí)需要已知的測量面積（或重量）?，F在有些品牌的光合儀允許測量完成后修正測量面積（或重量），重新計算光合速率，如德國WALZ的GFS-3000。
6、葉片溫度，葉片溫度是計算光合參數和控制氣體交換溫度的重要依據。因為光合儀的測量原理默認葉肉細胞內為100% 相對濕度。
7、葉室氣流流速，流經(jīng)葉室的氣流流速，與氣體交換參數計算有關(guān)。光合能力弱的陰生植物可以嘗試低流速測量。
8、日常維護，光合儀屬于精密的氣體分析儀器，為保證測量的準確性，應該定時(shí)做標定，標定程序分為CO2和H2O分析器零點(diǎn)標定和CO2和H2O分析器跨度標定。光合儀在環(huán)境因子控制過(guò)程中會(huì )消耗一些藥品，如干燥劑和堿石灰等，使用前后要注意檢查。光合儀作為野外便攜式測量設備，時(shí)常會(huì )被帶到野外去實(shí)驗，使用中務(wù)必留意電池電量狀況，及時(shí)保存數據，使用前后及時(shí)給電池充電。特別提醒，遠離水源！
>> 熒光儀 <<
1、熒光儀的種類(lèi)，目前常用的葉綠素熒光儀有兩種，脈沖調制式的和連續激發(fā)式的。脈沖調制式的可以在有環(huán)境光為背景的情況下使用，連續激發(fā)式的不可以。但是連續激發(fā)式的時(shí)間分辨率比脈沖調制式的高。脈沖調制式的葉綠素熒光儀通常用來(lái)測量淬滅分析，快速光曲線(xiàn)等。連續激發(fā)式的通常用來(lái)做快相分析。
2、暗適應，為了更好的對葉綠素熒光測量進(jìn)行合理的解釋?zhuān)绾味x光合機構在測量開(kāi)始時(shí)的狀態(tài)非常重要。所以，在大多數實(shí)驗中，無(wú)論脈沖調制式還是連續激發(fā)式葉綠素熒光儀，測量前一般需要首先進(jìn)行暗適應。葉片的暗適應狀態(tài)是光合機構的基本狀態(tài)。暗適應的方式有很多種，整株植物置于暗室，單個(gè)葉片放入暗適應夾，夜間測量。暗適應的時(shí)間長(cháng)短取決于我們希望從葉綠素熒光中得到什么信息。例如，大田作物葉片光合能力評價(jià)，暗適應時(shí)間一般只需要30分鐘。而實(shí)驗室內擬南芥葉片跨膜質(zhì)子梯度ΔpH的測量則需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(cháng)。
3、熒光儀光源，在熒光參數測量前對熒光儀光源有明確的認識是非常有必要的。以調制式的葉綠素熒光儀為例，通常會(huì )配置四種光，測量光ML，光化光AL，飽和脈沖光SP，遠紅光FR。測量光，光強比較弱（＜1μmolm-2s-1），具有調制頻率，用于信號檢測，測量前需要調整測量光強度(Int.)和頻率(Freq.)使熒光信號達到基本檢測要求。測量光強度過(guò)高， Fm 測定時(shí)可能會(huì )因為過(guò)飽和被低估，如果測量光強度太低，則不會(huì )使用滿(mǎn)量程，誤差增大。光化光，是誘導植物發(fā)生光合作用的光，又叫作用光。常見(jiàn)的熒光儀光化光光源有兩種， 460nm左右的藍光或630nm左右的紅光。光化光的強度通常也是可以調節的，以適應不同的實(shí)驗需求。但是請注意，光源出口與樣品的距離會(huì )改變樣品表面的光強。所以測量前務(wù)必明確到達樣品表面的光強具體是多少。很多設備的出廠(chǎng)設置都是預設的，安裝調試時(shí)最好執行光強校準，確保軟件或者報告里的PAR值與樣品水品的實(shí)際光強值一致。飽和脈沖，脈沖調制式熒光儀除了上述兩種光還有一種飽和脈沖光，而連續激發(fā)式熒光儀通常只有飽和脈沖光。飽和脈沖在熒光儀中通常是用來(lái)計算數據的，光強比較強，一般都要大于3000μmolm-2s-1。為適應不同樣品類(lèi)型和實(shí)驗要求，飽和脈沖的強度和持續時(shí)間通常也是可以調節的。遠紅光，有些品牌或型號的熒光儀還會(huì )搭載用于激發(fā)光系統Ⅰ的遠紅光，遠紅光可以用來(lái)測量Fo’，暗弛豫，狀態(tài)轉換。
4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm,最大光能轉換效率，反應植物潛在的最大光合能力。通過(guò)測量暗適應之后的最小熒光Fo和最大熒光Fm計算而來(lái)。該參數相對獨立，可以單獨使用，來(lái)評估脅迫條件下植物的光合特性變化或用來(lái)篩選突變體。大多數熒光儀都可以測。
5、ΦPSII，(Fm’-F)/Fm’, 實(shí)際光能轉換效率，反應植物在穩態(tài)下的實(shí)際光合能力，通過(guò)測量穩定環(huán)境（光溫水汽）狀態(tài)下的最小熒光F和最大熒光Fm’計算而來(lái)?？梢栽谇缋实奶鞖?，快速測量大量植物的光合特性。測量過(guò)程要同時(shí)采集環(huán)境參數，如光強，溫度等。
6、誘導曲線(xiàn)，Induction Curve，慢速熒光誘導動(dòng)力學(xué)（Slow Kinetics）的一種。測量誘導曲線(xiàn)可以獲得淬滅分析（Quenching Analysis）的參數，光化學(xué)淬滅(qP), 非光化學(xué)淬滅(NPQ)。實(shí)際應用中，誘導曲線(xiàn)后可以增加暗弛豫的測量，進(jìn)一步分析植物非光化學(xué)淬滅的能力。完整操作如下，先通過(guò)光化光誘導植物葉片達到穩態(tài)，測量光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅。然后關(guān)閉光化光，打開(kāi)遠紅光，繼續測量，直到植物在暗處再次達到穩態(tài)，測量暗穩態(tài)下的熒光淬滅。謹記，誘導曲線(xiàn)的測量需要暗適應。
7、光曲線(xiàn)，Light Curve，測量不同光強下的量子產(chǎn)量，計算電子傳遞速率ETR（ETR=PAR*Yield*吸光系數*0.5）。光曲線(xiàn)是光響應曲線(xiàn)的一種表征方式，相對于光合儀測氣體交換的A/Q曲線(xiàn)，熒光儀測量light Curve的時(shí)間可以短得多，所以又被稱(chēng)為快速光曲線(xiàn)(RLC)。光曲線(xiàn)可以擬合得到光能利用效率α，最大電子傳遞速率ETRmax，半飽和光強Ik，實(shí)現不同樣品光合特性的對比。
8、熒光成像，普通的熒光儀通常以數據報告的形式呈現測量結果，而熒光成像則可以將數據圖像化，直觀(guān)的展現樣品間的光合特性差異，極大地擴展了葉綠素熒光技術(shù)的應用。如今，熒光成像早已經(jīng)成為光合生理研究，遺傳育種，突變體篩選，病蟲(chóng)害早期檢測的常用工具。相比于普通的熒光儀，熒光成像的測量面積大，全葉片成像有助于分析葉片的橫向異質(zhì)性。熒光成像并不是面積越大越好，比面積更重要的是成像區域光場(chǎng)的均一性。均勻的廣場(chǎng)保證了葉片每一個(gè)部位的照光條件一致，實(shí)驗結果才更可靠。所以熒光成像的光源布局要經(jīng)過(guò)精心的的設計，就像手術(shù)臺的無(wú)影燈，照亮每一個(gè)看得見(jiàn)的角落。
熒光參數圖像（Belén Naranjo,etal. 2016）
再次聲明，光合作用研究?jì)x器沒(méi)有好壞之分，DIY或Custom-Made的測量系統照樣可以發(fā)好文章。正所謂光合儀器測量的數據千篇一律，有趣的idea萬(wàn)里挑一。再次祝各位老師，用好儀器，做好實(shí)驗，講好故事，發(fā)好文章！
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