2017年6月19日在RV Vettoria上采樣。地表水由船泵通過(guò)在線(xiàn)熱鹽計 (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，測量溫度和鹽度，并通過(guò)在線(xiàn)熒光計測量總熒光(CycloPS7，Turner Design 連接databank）。然后，水流過(guò)采樣裝置（Cytobuy BV)，并依次通過(guò)Cytosense流式細胞儀（Cytobuy BV）和OnCyt在線(xiàn)流式細胞儀。

盡管對于自養微微浮游生物（藍藻和微微真核生物），onCyt系統與傳統流式細胞術(shù)的比較已有報道，而且對于異養微生物，onCyt系統已用于淡水系統，但其在海水中的應用仍需測試。因此，我們調整了染色方案，以適應onCyt在培養溫度和時(shí)間方面的需要。為了保證測量的準確性，在含50 mM EDTA染色之前，樣品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物（1%和0.05%最終濃度）。使用CytSense和onCyt獲得的細胞計數與通過(guò)常規流式細胞術(shù)獲得的計數顯著(zhù)正相關(guān)，如圖所示，對于細菌，計數和亞群（高核酸，HNA和低核酸，LNA，圖1c和d）都適用。

圖1 通過(guò)CytoSense、onCyt和常規流式細胞術(shù)（Verse）獲得的數據驗證。

a）CytoSenseVs Verse藍藻聚球藻計數的相關(guān)性b）onCyt Vs Verse總異養細菌計數的相關(guān)性c）通過(guò)onCyt獲得的異養細菌的流式圖d）通過(guò)Verse獲得的異養細菌生的流式圖

上船后，兩臺流式細胞儀在熱鹽分析儀之后連接到船上的采樣線(xiàn)上。然后海水被分成兩條線(xiàn)，一條通向CytSense，另一條通向onCyt。兩臺儀器同時(shí)采集了樣本。

圖2 顯示了船的軌跡以及巡航期間收集的溫度、鹽度和熒光值。

兩個(gè)低鹽度區域很明顯，一個(gè)靠近港口（Torre Annunziata），另一個(gè)位于受薩諾河（Sarno）影響的區域。第一個(gè)位于離海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二條河流與薩諾河相對應，薩諾河流經(jīng)幾個(gè)農村和城市地區，然后排入那不勒斯灣。a）溫度，b）葉綠素熒光，c）航跡，d）鹽度。箭頭表示鹽度較低的地點(diǎn)，Torre Annunziata（上圖）和Sarno（下圖）

細菌總濃度顯示出這兩個(gè)區域對應的峰值，第一個(gè)區域（Torre Annunciata）的最高濃度為1.5 x 106cell/ml，第二個(gè)區域（Sarno）的濃度為1.4 x 106cell/ml（圖3）。盡管HNA在Torre Annunziata占主導地位，但HNA和LNA均存在于Sarno現場(chǎng)（未顯示），表明采樣軌跡沿線(xiàn)的群落組成發(fā)生了變化。事實(shí)上，HNA和LNA現在被識別為不同的細菌集群，最終代表了相同的較大分支，但屬于不同的分類(lèi)單元，而不像以前認為的那樣，是更多（HNA）或更少（LNA）活性細菌。

圖3 樣本軌跡（左側）和中異養細菌總濃度（右側）cell/ ml

在Sarno現場(chǎng)采集的樣本顯示存在大腸桿菌，這是近期糞便污染的指標，但在Torre Annunziata現場(chǎng)（Milva Pepi，pers.Comm.）沒(méi)有，這表明在僅根據細菌總濃度正確評估人類(lèi)健康風(fēng)險之前，進(jìn)一步進(jìn)行細菌分析的重要性。有毒藻類(lèi)也是如此，其中單獨的分類(lèi)鑒定并不總是與必須使用其他適當的檢測方法證明的毒素的存在相對應。

自養微生物組分也顯示出兩個(gè)區域之間的明顯分離，藍細菌聚球藻（Synechococcus）在南部地區占優(yōu)勢，而微微真核生物和隱藻在北部地區占優(yōu)勢（圖4）。這也證實(shí)了先前的觀(guān)察結果，表明原核生物（藍藻）與大型真核生物（微微真核生物和隱藻）對不同的環(huán)境線(xiàn)索做出反應，后者通常負責總葉綠素的峰值（如熒光模式所示，圖1b）。

自動(dòng)高頻流式細胞儀被證明是一種檢測海洋微生物的成本效益高、速度快的方法，允許實(shí)時(shí)測量細胞濃度與環(huán)境因素相關(guān)性，以便解釋和潛在地用作水質(zhì)標志，并為進(jìn)一步干預鋪平道路。反過(guò)來(lái)，微生物群落，特別是異養細菌，似乎是環(huán)境條件變化的有用標志，需要考慮并納入水質(zhì)評估，如歐洲指令2008/56/EC所要求的，其目標是在2020年內達到所有歐洲水域的良好環(huán)境狀態(tài)（GES）。

由于細菌細胞總數可能不會(huì )進(jìn)一步反映致病性或毒性對人類(lèi)健康的風(fēng)險，因此必須謹慎行事。然而，流式細胞術(shù)可能是首次篩選的一種有價(jià)值的方法，實(shí)時(shí)預警潛在的關(guān)鍵位點(diǎn)，以便通過(guò)其他方法進(jìn)一步監測和控制。