大豆的開(kāi)花時(shí)間和株型結構是對光周期極為敏感的，這限制了大豆優(yōu)良品種的引種推廣以及產(chǎn)量的提高。眾所周知，光信號通過(guò)光敏色素A（E3/E4）調節一個(gè)生物鐘夜間復合物（EC）關(guān)鍵組分J，以控制光周期性開(kāi)花。然而，其分子機制仍不清楚。
近日，中國農業(yè)科學(xué)院作科所和廣州大學(xué)的聯(lián)合研究團隊在《PNAS》在線(xiàn)發(fā)表了題為“GmEID1 modulates light signaling through the Evening Complex to control flowering time and yield in soybean”的研究論文，介紹了研究團隊發(fā)現大豆GmEID1蛋白作為連接E3/E4感知的光信號和生物鐘夜間復合物（EC）的橋梁，參與調控大豆開(kāi)花抑制因子E1基因表達。此外，研究發(fā)現GmEID1可作為調節大豆開(kāi)花時(shí)間的目標位點(diǎn)，在通過(guò)基因編輯和常規育種改良大豆的生態(tài)區適應性和產(chǎn)量方面有很大的潛力。1、GmEID1是開(kāi)花期的調控因子（圖1）。在長(cháng)日照（LD）條件下，大豆編碼光敏色素A識別蛋白的E3和E4基因會(huì )促進(jìn)豆科植物特異的開(kāi)花抑制子E1的表達，導致花期延遲。研究團隊通過(guò)RNA-seq方法挖掘到一個(gè)與E1相反的節律性表達模式的基因GmEID1，與擬南芥中的EID1（AtEID1）基因同源（該基因編碼一個(gè)F-box蛋白，參與PHYA介導的光信號傳導途徑）。與J基因類(lèi)似，GmEID1基因在地上組織高度表達（包括葉片和嫩梢組織），其亞細胞信號定位于細胞核中，這表明GmEID1很有可能參與大豆中GmPHYA介導的光信號傳導途徑。為了驗證這一猜想，研究團隊構建了Tianlong1（TL1）遺傳背景下的CRISPR/Cas9突變體Gmeid1-1和Gmeid1-2、Williams82（W82）遺傳背景下的CRISPR/Cas9突變體Gmeid1-3和Gmeid1-4、Tianlong1（TL1）遺傳背景下的35S::YFP-GmEID1過(guò)表達材料。表型分析結果顯示，在LD和SD條件下GmEID1基因敲除或者過(guò)表達分別會(huì )引起明顯的晚花或早花表型（圖1 B-D）。這表明GmEID1基因調控大豆的開(kāi)花與光周期無(wú)關(guān)。
圖1 GmEID1是一個(gè)開(kāi)花增強子基因
2、GmEID1抑制E1的轉錄（圖2）。為了深入了解GmEID1是如何促進(jìn)開(kāi)花的，研究團隊比較了在LD或SD條件下野生型TL1和Gmeid1突變體中關(guān)鍵開(kāi)花基因的晝夜表達水平。qRT-PCR結果表明，與TL1相比，GmFT2a和GmFT5a的mRNA水平在Gmeid1突變體中要低得多（圖2 A-D）。但與TL1相比，GmEID1過(guò)表達品系中的GmFT2a和GmFT5a的mRNA轉錄水平有所增加。同樣的，E1 的mRNA轉錄水平在Gmeid1突變體中被顯著(zhù)上調（圖2 E-F），在GmEID1過(guò)表達品系中則下調。有趣的是，E1上游的生物鐘組份基因J、GmCCA1a和GmPRR3b并沒(méi)有在晝夜條件下表現出明顯的變化，Gmeid1突變體和GmEID1過(guò)表達品系中均是如此。上述結果表明，GmEID1基因通過(guò)抑制E1的表達來(lái)促進(jìn)大豆開(kāi)花。
圖2 開(kāi)花期相關(guān)基因在敲除突變體和對照材料中的時(shí)間性表達
3、GmEID1與J互作促進(jìn)開(kāi)花（圖3）。鑒于GmEID1和J在抑制E1表達以及促進(jìn)開(kāi)花方面有相似的表現，再加上在Gmeid1突變體和GmEID1過(guò)表達品系中J的表達都沒(méi)有明顯的變化，研究團隊推測GmEID1可能通過(guò)與J的相互作用而發(fā)揮作用。與這一假設相一致的是，β-半乳糖苷酶活性試驗表明，GmEID1不僅與J/GmELF3a相互作用（圖3A），而且還與其他兩個(gè)ELF3同源蛋白GmELF3b-1和GmELF3b-2相互作用。此外，其他潛在的EC組份（包括GmELF4a和GmELF4b，但不包括GmLUX1和GmLUX2）也顯示了與GmEID1的相互作用的信號（圖3A）。GmEID1和GmELF3s之間的物理互作通過(guò)共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗和雙熒光素酶實(shí)驗得到了進(jìn)一步的證實(shí)。這些結果表明，GmEID1可能通過(guò)與GmELF3s和GmELF4s相互作用來(lái)影響EC的活性，從而調控開(kāi)花時(shí)間。4、GmEID1增強了J蛋白的表達豐度（圖3）。考慮到GmEID1是一個(gè)F-box蛋白，很有可能作為一個(gè)E3連接酶通過(guò)泛素途徑破壞目標蛋白的穩定性而發(fā)揮作用。為了測試GmEID1是否影響了J蛋白的穩定性，研究團隊通過(guò)構建野生型W82和突變體Gmeid1-4突變體背景下的35S::J-3xFlag根系誘導胼胝體表達（RICE）系統，比較多個(gè)遺傳轉化體系中的J蛋白表達豐度。結果顯示，W82遺傳背景下的J-Flag蛋白表達水平高于Gmeid1-4突變體背景，表明GmEID1與J-Flag的表達豐度呈正相關(guān)。特別的是，在W82背景下J-Flag蛋白的豐度與它的轉基因mRNA水平呈正相關(guān)，而Gmeid1-4突變體則不然。此外，Gmeid1-4突變體中的E1的的整體表達水平高于野生型。為了測試了GmEID1是以什么樣的表達模式來(lái)影響J蛋白的豐度，研究團隊選取了兩個(gè)表達水平相似的有代表性的根系誘導胼胝體，野生型W82背景的J-Flag/W82 #2和Gmeid1突變體背景的J-Flag/Gmeid1 #3（圖3 C-D）。免疫印跡結果表明，Gmeid1突變體中的J-Flag蛋白水平比野生型W82的低（圖3 C、E）。為了測試GmEID1和J之間的遺傳關(guān)系，研究團隊將W82遺傳背景的Gmeid1-3和Gmeid1-4的突變體與j突變體進(jìn)行雜交。分子分析表明，Gmeid1-4很可能是一個(gè)由移碼突變產(chǎn)生的功能缺失突變體，而Gmeid1-3可能是一個(gè)弱突變體，轉錄一個(gè)缺少17個(gè)氨基酸不完整的GmEID1蛋白。Gmeid1-4突變體比Gmeid1-3突變體開(kāi)花期更晚。在LD和SD條件下，j突變體的開(kāi)花期均與Gmeid1-3突變體相似，但比Gmeid1-4突變體早（圖3 F、G），這表明GmEID1不僅能穩定J蛋白，也能穩定其他的J相似蛋白，包括GmELF3b-1和GmELF3b-2（圖3 A-B）。此外，Gmeid1-3/j和Gmeid1-4/j的開(kāi)花期分別與Gmeid1-3和Gmeid1-4的開(kāi)花期相似（圖3 F、G），這表明GmEID1和J在同一遺傳途徑中發(fā)揮作用。
圖3 GmEID1與EC互作影響J蛋白的表達豐度來(lái)調控開(kāi)花時(shí)間
5、光依賴(lài)的E3/E4與GmEID1的互作，干擾了GmEID1與J蛋白的互作（圖4）。研究團隊通過(guò)β-半乳糖苷酶的活性測定實(shí)驗發(fā)現，在獨立的紅光或遠紅光條件下，光受體E3和E4能夠與GmEID1互作（圖4A）。Gmeid1/e3雙突變體的開(kāi)花期與Gmeid1突變體一樣晚（圖4B），這表明Gmeid1突變體可以完全抑制e3突變體的早花表型，GmEID1基因是E3基因的上游基因。接下來(lái)研究團隊通過(guò)Co-IP的方法鑒定E3是否影響GmEID1和J的互作（圖4C），結果顯示GmEID1-YFP和J-Flag蛋白不與E3-Flag蛋白共表達。無(wú)論是光照還是黑暗的條件，在沒(méi)有E3-Flag的情況下，J-Flag同樣能被GmEID1-YFP共沉淀。然而，在E3-Flag存在的情況下，白光或者遠紅光條件下，J-Flag被GmEID1-YFP共沉淀的量要比黑暗條件下少得多（圖4C）。以上結果表明光活化的E3/E4可以破壞GmEID1-J的互作，同時(shí)，E3/E4也許能促進(jìn)J蛋白的降解。為了驗證E3/E4能促進(jìn)J蛋白的降解猜想，研究團隊利用RICE系統比較了E3/E4存在或缺失情況下J-Flag的表達豐度。結果顯示，在e3或e3e4突變體背景下J-Flag蛋白表達水平高于野生型（圖4D）。研究團隊通過(guò)J-Flag mRNA表達水平和J-Flag蛋白轉錄水平之間的相關(guān)性分析發(fā)現，J-Flag蛋白在e3e4或e3突變體中的表達積累比野生型更高效（圖4F）。鑒于E3和E4介導光周期信號來(lái)調節開(kāi)花時(shí)間，研究團隊用一個(gè)穩定的過(guò)表達J-HA蛋白的轉基因大豆品系來(lái)測試晝長(cháng)是否會(huì )影響J蛋白的豐度。結果表明，J-HA蛋白的水平在SD條件高于LD條件（圖4 E、G）。耐人尋味的是，J-HA蛋白表達在光照期間逐漸逐漸增加，這可能與E3/E4的mRNA和蛋白質(zhì)在白天逐漸下降有關(guān)（圖4 G）。綜上所述，光活化的E3和E4作為一種競爭性的抑制子來(lái)干擾GmEID1-J的互作，從而促進(jìn)E1基因的表達，抑制大豆的開(kāi)花。
圖4 光活化的E3/E4與GmEID1互作抑制GmEID1與J的互作來(lái)促進(jìn)J蛋白的降解
6、GmEID1蛋白的失活能夠改良大豆的適應性和產(chǎn)量表現（圖5）。Gmeid1突變體除了開(kāi)花期延遲，還表現出主莖粗壯、節間變短、節數和分枝增多的表型。研究團隊在四個(gè)不同緯度地區（長(cháng)春、北京、許昌和三亞）對該材料進(jìn)行了產(chǎn)量的評估，結果顯示Gmeid1的單株產(chǎn)量在各地區均顯著(zhù)增加，尤其是在TL1親本品種的主要推廣地（許昌），在正常種植密度下Gmeid1的單株產(chǎn)量較親本增產(chǎn)17.2%。
圖5在一個(gè)廣泛的維度區域內，GmEID1基因的截斷能夠增加大豆的產(chǎn)量
綜上所述，研究團隊不僅解析了大豆GmEID1蛋白作為連接E3/E4和EC復合物的橋梁進(jìn)而調控E1表達的分子機制，同時(shí)創(chuàng )制的Gmeid1突變體表現良好的環(huán)境適應性和增產(chǎn)潛力，為大豆育種提供了重要的基因資源。
Qin C, Li H, Zhang S, et al. GmEID1 modulates light signaling through the Evening Complex to control flowering time and yield in soybean[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2023, 120(15): e2212468120.
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