如今市面上有很多被稱(chēng)為葉綠素熒光成像系統的設備。單就設備的型號來(lái)講，已經(jīng)不下十幾種，如，***PAM，***CAM，***Explorer，***View等等，進(jìn)口的，國產(chǎn)的，封閉式的，開(kāi)放式的，多功能的，多光譜的，高通量的，那叫一個(gè)眼花繚亂。如果這個(gè)時(shí)候廠(chǎng)家再給你一堆花花綠綠的圖片在您眼前不斷的閃現，請問(wèn)您該如何和判斷這是什么？我要的是什么？好難！
葉綠素熒光成像系統是測量光合作用光反應能量轉換過(guò)程釋放的葉綠素熒光的成像工具。首先它是測量葉綠素熒光的，其次它可以成像。這下反而簡(jiǎn)單了。
測量葉綠素熒光的方法有很多種，目前受歡迎和應用廣泛的是脈沖振幅調制(PAM)方法。下面的測量流程以脈沖振幅調制方法展開(kāi)：在開(kāi)始測量之前，葉片必須經(jīng)過(guò)幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應，這取決于測量前葉子所處光環(huán)境的光強度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過(guò)低強度測量光（Measure Light, ML）獲得，而暗適應葉片的最大熒光產(chǎn)量Fm則用飽和光脈沖(Saturation Pulse, SP)進(jìn)行評估。在光化光照明(Actinic Light, AL, 即施加的光強度）下，可以使用另一個(gè)飽和脈沖估計光適應狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關(guān)閉之前測量熒光的穩態(tài)水平Fs。除此之外，在關(guān)閉AL后(有時(shí)需要開(kāi)遠紅光Far Red Light, FR)，可以測到另一個(gè)葉綠素熒光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據這些測量的基本葉綠素熒光參數，可以計算出其他一些更常用于葉綠素熒光分析的參數。
葉綠素熒光測量解決了，下面該討論成像了。葉綠素熒光成像可沒(méi)那么簡(jiǎn)單，因為它不單單是拍照。拍照是一門(mén)光學(xué)藝術(shù)，風(fēng)景，人物拍照講究個(gè)構圖得當，光線(xiàn)協(xié)調，亮暗對比，但是這些都不適用于葉綠素熒光成像。葉綠素熒光成像該考慮哪些因素呢？
首先要考慮的是測量區域光場(chǎng)的均勻性。所謂的測量區域光場(chǎng)的均勻性是指在成像區域內，各個(gè)不同位點(diǎn)的光強差異，差異越小，光場(chǎng)越均勻。光場(chǎng)內的光強包括測量光，光化光，飽和脈沖光，遠紅光。是否均勻是衡量葉綠素熒光成像數據是否有效的基本原則。因為只有在光場(chǎng)均勻的情況下，才可以保證成像區域內樣品上的每一點(diǎn)接受到的光強是一致的，才可以進(jìn)行多葉片同時(shí)測量，才可以進(jìn)行橫向異質(zhì)性分析。否則，數據的有效性無(wú)從談起。實(shí)踐證明，熒光成像系統并不是成像面積越大越好，首先要考慮的是成像均勻。如果光場(chǎng)不均勻，再大的成像面積也是無(wú)效面積，外圍和中心的測量結果也不具備可比性。
成像區域108個(gè)點(diǎn)的光強數據
其次要考慮的是工作距離。所謂的工作距離是指樣品和測量系統的光源以及成像的鏡頭的空間距離。工作距離和光場(chǎng)的均勻性是密切相關(guān)的，換句話(huà)說(shuō)，光場(chǎng)在一個(gè)工作距離下是均勻的，換一個(gè)工作距離就不一定了。其次工作距離還影響樣品表面接收到的光強，距離越遠接收到的光強越弱。實(shí)際應用中，如果工作距離發(fā)生變化，請務(wù)必重新做光強校準。否則樣品實(shí)際接收的光強可能會(huì )與軟件顯示的光強不一致，不能正確反應樣品的實(shí)際生理狀態(tài)。
第三要考慮的是成像面積。所謂的成像面積是在設定的工作距離下測量區域光場(chǎng)均勻的有效面積。由此可見(jiàn)，成像面積和工作距離是密切相關(guān)的，光場(chǎng)均勻的區域才算有效面積，有效面積內的所有位置被無(wú)差別測量，圖像內的所有信息才有可比性。
第四個(gè)要考慮的是光源光強。光強包括測量光，光化光，飽和脈沖光的光強。1.測量光，它既不能太強，也不能太弱。測量光太弱，無(wú)法將本底熒光全部激發(fā)出來(lái)，導致飽和脈沖測量的可變熒光Fv包含部分Fo，Fv被高估。測量光太強，會(huì )破壞暗適應的狀態(tài)，導致測量的Fv被低估。2.光化光，它是在葉綠素熒光測量過(guò)程中誘導植物發(fā)生光合作用的光，通常強度是可調的。如果使用葉綠素熒光成像系統測量光響應曲線(xiàn)的話(huà)，光化光的強度通常需要達到1500-2000 μmol m-2 s-1。3.飽和脈沖光，它是用來(lái)測量和計算數據的光，在飽和脈沖期間，光系統被全部關(guān)閉，此時(shí)可以根據熒光發(fā)射的多少計算光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅以及電子傳遞。飽和脈沖光的強度通常需要在3000-5000 μmol m-2 s-1以上。
總結一下，目前的葉綠素熒光成像系統還是一個(gè)平面2D應用的測量系統。您也許會(huì )說(shuō)，植物是立體的呀！是的，植物沒(méi)有錯，但是考慮到光源，成像鏡頭和樣品的空間距離是線(xiàn)性的。所以葉綠素熒光成像也是平面2D的，既然是平面測量系統，那么就要考慮成像區域的光場(chǎng)均勻性，就要時(shí)刻注意光源和鏡頭與葉片之間的距離，一個(gè)實(shí)驗中的所有樣品要以相同的距離進(jìn)行測量。測量前準備階段的光強校準也要在這個(gè)距離下進(jìn)行。最后，葉綠素熒光成像系統的光源配置要滿(mǎn)足葉綠素熒光測量的基本要求。
所以，我們想從專(zhuān)業(yè)服務(wù)的角度給各位老師和同學(xué)提兩點(diǎn)建議。1.如果您正在使用葉綠素熒光成像系統，請認真思考上面提到的四點(diǎn)，非常重要。2.如果您計劃采購葉綠素熒光成像系統，同樣需要關(guān)注上面提到的四點(diǎn)，非常重要！
除了上面提到的四點(diǎn)以外，葉綠素熒光成像系統還有一些其他的技術(shù)參數需要注意，比如CCD的幀率，鏡頭的焦距，對焦，光圈等，這些參數也會(huì )影響成像結果，您把它比作一臺數碼相機就很好理解了。下面我們分別了解一下這幾個(gè)參數。
1.CCD的幀率：理論上幀率越高，畫(huà)面越流暢，但也不是幀率越高越好，它還取決于顯示終端的顯卡配置，被測光源類(lèi)型。百度百科搜索“幀率”您會(huì )看到以下內容“大多數研究參與者認為調制光穩定。這種調制光的穩定感被稱(chēng)為閃爍融合閾值。然而，當調制光是不均勻的并且包含圖像時(shí)，閃爍融合閾值可以高得多，數百赫茲”。如果我沒(méi)理解錯的話(huà)，調制光如果不均勻的話(huà)，閃爍融合閾值越高，圖像穩定感越差。目前大多數葉綠素熒光成像系統的幀率為每秒30幀，屬于正常水平，也相當的穩定可靠。另外一點(diǎn)，葉綠素熒光成像系統是一個(gè)”拍照“設備，不是一個(gè)“錄像”設備。無(wú)論您使用的是脈沖式還是調制式，我們都需要用到飽和閃光測量葉片的“瞬時(shí)”狀態(tài)并成像，輸出的也都是2D圖像，所以無(wú)需過(guò)分糾結幀率。
2.鏡頭焦距，對焦，光圈：這三個(gè)屬于鏡頭的常規參數，其實(shí)沒(méi)什么好說(shuō)的，但是如果不注意的話(huà)還是會(huì )影響測量結果。A，焦距可以放大（拉近）/縮?。ǚ胚h）圖像，調整焦距并不會(huì )改變葉片與鏡頭和光源的距離。對測量不會(huì )產(chǎn)生本質(zhì)性的影響。B，對焦可以使圖像邊緣更加清晰，通常調整焦距后都需要重新對焦，否則圖像中的葉片邊緣可能是模糊的，輸出的熒光參數圖像里的葉片邊緣也是模糊的。C，光圈由通光孔葉片組控制的位于鏡頭中央的圓孔，光圈的大小決定了通過(guò)鏡頭到達檢測器的光線(xiàn)多少。這里值得一提的是光圈F/值越小，光圈孔徑越大，進(jìn)入的光線(xiàn)越多，圖像越明亮。所以在測量過(guò)程中最好不要隨意更改光圈大小，特別是在用葉綠素熒光成像系統測量吸光度Absorptivity(Abs.)的時(shí)候，更是嚴禁調整光圈大小，如果不小心調了，需要重新調整Abs.測量所用光源的參數。如果之前沒(méi)在意光圈大小，做預實(shí)驗時(shí)發(fā)現測量光調到最低（Meas light Int.=1，Gain=1）AOI的Ft仍大于測量要求的上限值，此時(shí)需要先調整光圈，然后再到Settings設置測量參數。相反，如果測量光已經(jīng)調到很大，AOI的Ft仍不到測量要求的下限值，也需要先調整光圈，然后再到Settings設置測量參數。
M系列的MINI版的探頭是葉夾式的，可以直接夾住葉片測量即可，可以攜帶至野外使用。
M系列MICROSCOPY版是用于微藻或葉片顯微結構組織水平測量的系統。
3D版是套機，光源和鏡頭都固定在框架上，不可拆卸，3D版除了葉綠素熒光成像以外可以用于小型植株（擬南芥）3D成像，分析植株的表型，如葉片數量，葉面積等。
Mobile版是MINI版的變形，是專(zhuān)為雜草或貼地植物設計的版本，符合人體工學(xué)的背帶，延長(cháng)的手柄大大提高了野外測量的便攜性，非常適合研究除草劑對雜草作用效果，在除草劑的研發(fā)和雜草管理上積累了大量的應用。
IMAGING-PAM不僅僅是數據圖像化那么簡(jiǎn)單。
IMAGING-PAM葉綠素熒光成像系統發(fā)表的文章非常多，涉及的樣品類(lèi)型五花八門(mén)，最常見(jiàn)的有擬南芥植株，單個(gè)葉片，藻液，藻斑，苔蘚，珊瑚，甚至還有愈傷組織。針對不同的樣品類(lèi)型，測量時(shí)面臨的實(shí)際問(wèn)題也千差萬(wàn)別。比如，我們要求原位活體測量，盡量不要離體，但是有些植株體量比較大，無(wú)法整個(gè)放到成像區域，再比如有些樣品葉柄比較短，也同樣面臨類(lèi)似的問(wèn)題，還有測量藻液，如何才能避免液面的反光等等。當我們遇到上面這些問(wèn)題時(shí)該如何解決，怎么樣才能保證測量是準確的？
具體情況需要具體分析，如果要展開(kāi)講，一篇文章也不一定能講清楚，但我們還是根據經(jīng)驗還是總結了一些比較重要的注意事項，通過(guò)這篇文章分享給大家。澤泉科技作為WALZ的技術(shù)服務(wù)中心，對IMAGING-PAM特別熟悉，所以以它為例來(lái)講，如果您用的是其它品牌或型號的葉綠素熒光成像系統，也可以參考，畢竟原理是相通的。倘若下文內容與您接受設備培訓聽(tīng)到的測量理論有差別，歡迎各位讀者朋友留言咨詢(xún)，我們可以詳細交流，共同學(xué)習。
首先，我們可以看看IMAGING-PAM成像的圖片在文獻中是什么樣子的。然后再了解實(shí)際應用中有哪些使用要求，變形方式。下面的圖片展示了IMAGING-PAM測量擬南芥植株，擬南芥平板，大型植株，盛放藻類(lèi)懸浮液的多孔板，巖石附著(zhù)藻，苔蘚等出現在發(fā)表文章中的圖片。不難看出，IMAGING-PAM在不同類(lèi)型的樣品中積累了大量的應用。
下面，我們以經(jīng)典的MAXI-IMAGING-PAM來(lái)看看在實(shí)際應用中根據不同樣品類(lèi)型它有哪些變形方式。從下圖中不難看出，只需要簡(jiǎn)單的更改組裝方式，即可實(shí)現封閉，半開(kāi)放，開(kāi)放式測量。離體葉片，盆栽，大型植株，盛放藻類(lèi)的96孔板均可輕松搞定。
不同組裝方式可以讓系統變得靈活，適用多變的實(shí)驗需求，但是測量的本質(zhì)沒(méi)有變，還是葉綠素熒光。所以，一些測量的基本原則必須搞清楚，如工作距離，成像面積，測量區域光場(chǎng)的均勻性，光強（光化光+飽和脈沖）的強度等等，以上這些因素都會(huì )影響到您的實(shí)驗結果。
1. 測量區域光場(chǎng)的均勻性：MAXI版的IMAGING-PAM光源陣列的LED排布是經(jīng)過(guò)精心設計的，目的就是為了保證測量區域光場(chǎng)均一。經(jīng)測算，MAXI 版IMAGING-PAM的光場(chǎng)均一性在標準工作距離18.5 cm時(shí)最優(yōu)可達2%。MINI版本的IMAGING-PAM光源為四角相對排布，外圍尺寸9.4×8.6 cm，但是為了保證成像區域光場(chǎng)均勻，實(shí)際的成像面積則僅保留了2.4×3.2 cm的有效區域。測量區域光場(chǎng)的均勻性同樣是HEXAGON版本的旗艦參數。無(wú)論是MAXI版還是MINI版，再到現在最新的HEXAGON，德國WALZ始終堅守著(zhù)該項技術(shù)的嚴謹性。
2.工作距離：為以MAXI版為例，工作距離根據組裝方式的不同可以實(shí)現14.5-22.5 cm可調。標準設置下，打開(kāi)成像單元紅色的護眼罩，放入樣品架，然后在樣品架上放置葉片，葉片平展，此時(shí)葉片表面距離光源和鏡頭的距離即為標準工作距離18.5 cm。如果LED陣列和鏡頭脫離護眼罩，則可以很方便的調整工作距離。MINI版本的工作距離通常為固定的7 cm。HEXAGON版本的標準工作距離為20 cm。
3.成像面積：MAXI版工作距離為14.5 cm的時(shí)候，成像面積為7.5×10 cm；工作距離為22.5 cm的時(shí)候，成像面積是11×15 cm。MINI版工作距離為固定的7 cm，成像面積為2.4×3.2 cm。HEXAGON在標準工作距離下成像面積為20×24 cm。IMAGING-PAM的成像面積即為有效面積，有效面積內的所有位置被無(wú)差別測量。
4. 光源光強，以MAXI版IMAGING-PAM目前搭載的LED光源陣列為例，需要300 W的額外供電。標準工作距離18.5 cm，光化光最大可達1900 μmol m-2 s-1PAR，大大超過(guò)所有植物的光飽和點(diǎn)。飽和脈沖最高可達4000 μmol m-2 s-1PAR，足夠關(guān)閉所有光系統的反應中心。HEXAGON-IMAGING-PAM的光源性能有了大幅的提升，標準工作距離20 cm，光化光最大可達3000 μmol m-2 s-1PAR，飽和脈沖最高可達5000 μmol m-2 s-1PAR，因此HEXAGON-IMAGING-PAM在工作距離上還有一定的調整空間。
IMAGING-PAM有非常多的應用，在我們整理的光合作用文獻數據庫中，是發(fā)表文章較多的型號，單個(gè)型號超過(guò)1800篇。2021年，IMAGING-PAM參與發(fā)表的相關(guān)論文曾兩次登上專(zhuān)業(yè)期刊的封面。德國WALZ掌握葉綠素熒光成像系統的核心技術(shù)。IMAGING-PAM，值得您的信任~
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