全球氣候變暖導致的高溫嚴重威脅農作物產(chǎn)量，而光合作用是作物產(chǎn)量形成的重要因素，同時(shí)也是對高溫最敏感的生理過(guò)程之一，高溫脅迫會(huì )破壞葉綠體功能，包括葉綠素合成、光化學(xué)反應效率和電子傳遞鏈活性。因此產(chǎn)生抑制光合作用效率阻礙植物生長(cháng)并降低作物產(chǎn)量的負面作用，然而其分子機制尚未完全闡明。

高等植物線(xiàn)粒體和葉綠體作為半自主細胞器含有部分遺傳物質(zhì)，可以轉錄編碼自身所需蛋白質(zhì)的RNA，且該RNA存在大量的編輯位點(diǎn)。植物葉綠體和線(xiàn)粒體的RNA編輯(C-U)是校正轉錄本錯誤的重要過(guò)程,異常的RNA編輯可導致植物發(fā)育缺陷和非生物脅迫響應失調。編輯過(guò)程依賴(lài)于編輯體(editosome)，其核心組分包括：1.PPR蛋白，通過(guò)序列特異性識別靶RNA位點(diǎn)。2.MORF家族蛋白（如MORF8），與PPR蛋白互作，增強其RNA結合能力。脫氨酶：催化C(胞嘧啶)到U(尿嘧啶)的化學(xué)修飾。MORF8是唯一一種在葉綠體和線(xiàn)粒體中雙重定位的蛋白家族成員，其功能缺失會(huì )導致胚胎致死，表明其在RNA編輯中的核心地位。RNA編輯對葉綠體中光合作用相關(guān)基因的調控至關(guān)重要，而熱脅迫則顯著(zhù)抑制這一過(guò)程。那么熱脅迫是如何調控RNA編輯過(guò)程的？熱脅迫對光合作用的影響是否能夠通過(guò)對RNA編輯過(guò)程的調控來(lái)實(shí)現？

2025年3月21日，Nature Communications在線(xiàn)發(fā)表了清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院方曉峰課題組題為“Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis”的研究論文。該研究發(fā)現，葉綠體定位的MORF8蛋白能夠在熱脅迫下形成固態(tài)凝聚體，并招募特定的RNA編輯因子PPR蛋白進(jìn)入凝聚體中以減弱PPR蛋白與其靶向RNA的結合能力，從而降低葉綠體中對應RNA位點(diǎn)的編輯效率，最終導致光合膜蛋白復合體(如NDH-PSI)活性受損，光合作用效率下降(下圖)。

MORF8蛋白相分離工作模型。正常溫度條件下，MORF8促進(jìn)PPR蛋白與RNA結合；熱脅迫誘導條件下，固態(tài)凝聚體形成，隔離編輯體組分，抑制NDH復合體功能。

該研究發(fā)現，RNA編輯因子MORF8能夠特異性地響應熱脅迫發(fā)生相分離。42°C處理10分鐘后，葉綠體內MORF8凝聚體數量增加5倍(圖1a)。FRAP顯示熒光恢復率僅8%(圖1d)，且1,6-己二醇處理不溶解凝聚體(圖1e)。此外，體外數據表明，IDR(蛋白質(zhì)固有無(wú)序區域)是相分離的關(guān)鍵，ΔIDR突變體完全喪失凝聚能力(圖2e)。DLS(動(dòng)態(tài)光散射)顯示IDR單獨響應溫度變化，37°C時(shí)粒徑從10 nm增至250 nm(圖2j)。上述結果表明MORF8通過(guò)IDR直接感知溫度，形成固態(tài)凝聚體，可能通過(guò)降低蛋白流動(dòng)性實(shí)現持久脅迫響應。在煙草和擬南芥中的一系列實(shí)驗也都證實(shí)了MORF8的凝聚體是固態(tài)的，并且能夠通過(guò)離心分離獲得凝聚體組分。

圖1 MORF8蛋白響應熱脅迫形成固態(tài)凝聚體。

圖2 MORF8蛋白的體外相分離特性

MORF8凝聚抑制RNA編輯效率方面的研究數據表明，amiR-MORF8植株中，23/34個(gè)葉綠體編輯位點(diǎn)效率下降>50%(圖3a)；過(guò)表達MORF8導致16個(gè)位點(diǎn)(如ndhD-2)效率降低30%-90%(圖3b)。生化機制相關(guān)的EMSA分析顯示，MORF8凝聚體將PPR蛋白DGI與ndhD RNA的結合減少70%(圖5c-e),表明進(jìn)入凝聚體的PPR蛋白與靶標RNA的結合能力顯著(zhù)降低，這意味著(zhù)MORF8的聚集是不利于有活性的編輯體組裝的。質(zhì)譜鑒定到CRR21等PPR蛋白被招募至凝聚體(圖4e-g)。上述研究結果表明固態(tài)凝聚體通過(guò)隔離編輯體組分抑制RNA結合，且不同刺激(過(guò)表達vs.熱脅迫)可能動(dòng)態(tài)改變凝聚體組成。

該研究進(jìn)一步評估了NDH復合體功能受損對光合作用的影響。蛋白表達水平方面，免疫印跡顯示，熱脅迫8小時(shí)后NdhH蛋白減少60%(圖6d)。BN-PAGE顯示NDH-PSI超復合體減少50%(圖6f)，葉綠素熒光分析表明NDH活性下降65%(圖6e)。ndhD-2編輯缺陷導致NDH復合體組裝失敗，破壞PSI循環(huán)電子傳遞，加劇光抑制和ROS積累?？傊芯空咄ㄟ^(guò)對一系列體內實(shí)驗和光合作用相關(guān)參數的比較分析，建立了MORF8蛋白的相變與光合作用調控機制的耦合關(guān)系(圖6)。

圖6 MORF8凝聚損害NDH活性與光合作用

綜上所述，本研究首次揭示MORF8蛋白通過(guò)固態(tài)相分離調控葉綠體RNA編輯的熱響應機制，闡明了高溫抑制光合作用的分子通路。量化數據表明，熱脅迫通過(guò)降低關(guān)鍵編輯位點(diǎn)效率(如ndhD-2編輯效率下降60%)，導致NDH活性喪失和光合損傷。這一發(fā)現為作物抗逆性改良提供了新靶點(diǎn)，并拓展了相分離在植物逆境生物學(xué)中的研究維度。

Wu, J., Wang, Y., Chen, H. et al. Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis. Nature Communications 16, 2789 (2025). 

如圖6.e所示，使用PAM葉綠素熒光儀(如PAM-2500，DUAL-PAM-100等)測量光化光關(guān)閉后葉綠素熒光瞬時(shí)上升的動(dòng)力學(xué)軌跡(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence)可以用來(lái)表征NDH介導的環(huán)式電子傳遞活性，因此該方法也稱(chēng)為NDH活性測量。該方法測量的流程非常簡(jiǎn)單，使用暗適應的葉片先在測量光下記錄最小熒光Fo，之后用光化光誘導樣品達到穩態(tài)，最后關(guān)閉光化光記錄熒光信號的上升。根據作用光關(guān)閉后熒光信號上升曲線(xiàn)的斜率來(lái)評定循環(huán)電子傳遞的快慢，斜率越大，循環(huán)電子傳遞速率越快，反之越慢。

圖片來(lái)自《光合作用研究技術(shù)》

使用PAM熒光儀測量NDH活性的操作要點(diǎn)如下：

1、表征NDH活性的測量對象為PSII熒光(Fluo)。

2、建議使用毫秒(1ms)級時(shí)間分辨率采集熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

3、測量光低頻(MF-L)不宜太低，建議設置為500-1000Hz。

4、為了使樣品初始狀態(tài)沒(méi)有光抑制或記憶效應的影響，建議暗適應后或在低光強下開(kāi)始并避光測量。暗適應樣品可以測FoFm，低光強下開(kāi)始就無(wú)需測FoFm了。

5、PAM熒光儀支持手動(dòng)進(jìn)行一次完整測量動(dòng)作后保存測量流程，重復測量。

使用PAM熒光儀測量NDH活性的操作流程如下：

1、慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)窗口將運行模式改為Manual。

2、將樣品加在暗適應葉夾，如果是開(kāi)放葉夾(如2035-B葉夾或DUAL-PAM-100的探頭)需遮蔽環(huán)境光。

3、打開(kāi)測量光，觀(guān)察Ft(或Fluo)信號值，建議使Ft(或Fluo)在0.2-0.6之間，比如0.3或0.4。確認Ft(或Fluo)滿(mǎn)足測量要求后，關(guān)閉測量光。

4、選擇一個(gè)中低強度的光化光作為誘導實(shí)驗的光強，實(shí)驗室/溫室等室內培養的植物，建議50-100 μE，室外植物可以考慮使用略高的光強，如100-200 μE。 

5、在Manual模式下開(kāi)始(Start)慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(Slow Kinetics)。

6、等待3-5秒，讀取基線(xiàn)，此時(shí)熒光信號應該為0。

7、打開(kāi)測量光，熒光信號上升至預設值(比如0.3或0.4)。

8、等待3-5秒，讀取只有測量光時(shí)的基線(xiàn)，此時(shí)熒光信號應該為一條接近水平的線(xiàn)。

9、如果需要，可以點(diǎn)擊[FoFm]，測量Fv/Fm，如果不需要，可省略此步驟。

10、打開(kāi)光化光，直至熒光曲線(xiàn)走平穩定。

11、關(guān)閉光化光，直至曲線(xiàn)鼓起后再下降至走平穩定。

12、點(diǎn)擊Stop，結束慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(Slow Kinetics)13，手動(dòng)關(guān)閉測量光

13、如果您用的是PAM-2500，測量完成后，在慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)窗口將運行模式改為T(mén)rig. Run，會(huì )彈出一個(gè)對話(huà)框，用來(lái)保存剛才的操作流程。您可以看到動(dòng)作的時(shí)間節點(diǎn)是毫秒(ms)。根據個(gè)人需要，可以將時(shí)間節點(diǎn)改為整數后保存。后續實(shí)驗只需更換樣品后，在Trig. Run模式下點(diǎn)Start即可。

14、如果您使用的是DUAL-PAM-100，測量完成后需要點(diǎn)擊曲線(xiàn)右邊的“Copy Trig. Run from Man. Rec”按鈕，將剛才手動(dòng)執行的所有操作Copy到Settings→ Trig. Run窗口并生成Trigger文件。點(diǎn)擊保存，存儲Trigger文件用于后續實(shí)驗使用即可。后續實(shí)驗只需更換樣品，將慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(Slow Kinetics)運行模式改為T(mén)rig. Run，點(diǎn)擊Start即可。

15、將Manual和Trig. Run測量的慢速動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)導出，截取光化光關(guān)閉前-后時(shí)間區間內的動(dòng)力學(xué)軌跡作圖，分析即可。

注1：PAM軟件里，μE=μmol m?2 s?1

注2：早期的培訓資料里，NDH活性的測量還可以通過(guò)Script完成，后來(lái)由于Script的執行時(shí)間節點(diǎn)為秒(s)，導出數據作圖時(shí)時(shí)間節點(diǎn)無(wú)法完全統一，使用越來(lái)越少了。

電話(huà)：021-32555118，郵箱：sales@zealquest.com