室溫下活體葉綠素熒光及光誘導的熒光變化由光系統II中激發(fā)的峰值在685 nm左右的葉綠素a熒光主導。光系統I熒光，F（I），峰值約730 nm，到目前為止被認為在活體中是恒定的。在這里，我們提出證據表明在綠色單細胞藻類(lèi)小球藻、藍藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片中，F（I）對可變熒光有顯著(zhù)貢獻。本研究用多激發(fā)波長(cháng)調制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM測量了440 nm強光在小球藻稀懸液中誘導的多相熒光上升（O-I1-I2-P），檢測波長(cháng)分別在700 nm以上（F>700）和710 nm以下（F<710）。通過(guò)對F>700和F<710記錄的10條曲線(xiàn)取平均值，即使是很小的差異也能得到可靠的評估。對構成特定F（II）響應的O-I1相振幅進(jìn)行標準化后，兩次記錄的O-I1-I2相接近相同，但F>700的I2-P相為F<710的1.42倍。用625 nm強光化光在暗狀態(tài)2下對聚球藻進(jìn)行的類(lèi)似測量中，在O-I1標準化后，F>700的I2-P相甚至超過(guò)F<710的I2-P相1.99倍。在對小球藻的測量中，中等光化背景光和質(zhì)體醌拮抗劑DBMIB抑制了其I2-P相及PSI表觀(guān)可變熒光Fv（I）。對葉片的類(lèi)似測量由于不可避免的光強梯度及由此產(chǎn)生的F>700和F<710的異質(zhì)來(lái)源而變得難以確定。但是一片淡綠色的常春藤幼葉定性地與懸浮液的結果相似，因此強烈地暗示葉片中也存在Fv（I）。
本研究是德國WALZ首席科學(xué)家，PAM熒光儀發(fā)明人，德國伍茲堡大學(xué)教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長(cháng)調制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM做出的。該設備在具備極高靈敏度的同時(shí)又具有很高的時(shí)間分辨率，非常適合于研究不同光質(zhì)的強光誘導下葉綠素熒光快速細微的變化過(guò)程。文章發(fā)表在2021年1月的Photosynthesis Research上。
圖1 用于測量F>700（1 mm RG9+2 mm低熒光RG665）和F<710（短通710 nm+2 mm低熒光RG665）的探測器濾光片組的透射光譜
圖2 使用Multi-Color-PAM在F>700(紅色)和F<710(藍色)測得的小球藻多相熒光上升曲線(xiàn)的比較。440 nm脈沖調制測量光和440 nm光化光（4018 μmol m?2 s?1）。葉綠素含量200 μg L-1。每隔5分鐘交替測量10次F>700和F<710曲線(xiàn)的平均值。弱遠紅光背景（1 μmol m?2 s?1 730 nm），用于誘導PS II供體和受體側狀態(tài)的標準參考條件，并考慮長(cháng)期再現性。圖為PamWin-3軟件快速動(dòng)力學(xué)窗口的原始截圖。
圖3 對F>700響應進(jìn)行重縮放后，F>700(紅色)和F<710(藍色)信號的比較，以給出與F<710響應中相同的O-I1相位振幅。根據圖2所示的原始數據得出。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm。I1平臺在1 ms時(shí)到達(綠色垂直折線(xiàn))。黑色垂直虛線(xiàn)放置在40 ms處，以標記I2-P階段的開(kāi)始。使用Schreiber（1986）的原始命名法表示特征熒光水平O=Fo、I1、I2和P=Fm。a對數時(shí)間刻度。b線(xiàn)性時(shí)間刻度
圖4 標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線(xiàn)的比較。通過(guò)減去各自Fo值從圖3中的數據導出
圖5 根據圖4所示的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線(xiàn)之間的差異得出的可變PS I熒光Fv（I）的動(dòng)力學(xué)。坐標縮放如圖3所示。a組，線(xiàn)性時(shí)間刻度。b組，對數時(shí)間刻度
圖6 用96 μmol m?2 s?1 440 nm在恒定照光狀態(tài)下測量的多相熒光上升曲線(xiàn)導出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線(xiàn)的比較。除背景照明外，使用相同的樣品進(jìn)行與圖4的實(shí)驗相同的條件。F>700和F<710記錄各取10個(gè)平均值。比例與圖4相同。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm
圖7 在1 μM DBMIB存在下測量的多相熒光上升曲線(xiàn)得出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線(xiàn)的比較。另外，與圖4的實(shí)驗條件相同，用與圖4和圖6的測量樣品相同。在弱遠紅光背景下，連續光照終止后2 h，在DBMIB存在下開(kāi)始測量?？s放比例與圖4和6相同。應用4018 μmolm?2 s?1 440 nm
圖8 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為小球藻中的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，通過(guò)標準化I2-P對F（I）進(jìn)行重標度。F（II）(綠色)由標準化O-I1 F>700(紅色)減去標準化I2-P F（I）(黑色)得到。表明了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅
圖9 根據在>700 nm和<710 nm處測量的強光照開(kāi)始時(shí)誘導的多相熒光上升曲線(xiàn)的平行記錄，在暗色素狀態(tài)2下，聚球藻中Fv（I）的定量。激發(fā)：脈沖調制440 nm ML。光化光：4229 m?2 s?1 625 nm加891 μmol m?2 s?1 440 nm（高頻脈沖調制ML）。每條曲線(xiàn)是4次記錄的平均值，每5分鐘交替測量一次F>700和F<710。a對F>700響應重新縮放后的F>700(紅色)和F<710(藍色)信號進(jìn)行比較，得出與F<710響應相同的O-I1相振幅。b O-I1平衡Fv>700和Fv<710反應的比較。顯示了特征熒光水平。
圖10 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為黑暗狀態(tài)2下的聚球藻的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，對F（I）進(jìn)行重定標。F（II）(綠色)由標準化O-I1的F>700(紅色)減去標準化I2-P的F（I）(黑色)得到。顯示了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅
圖11 從淺綠色常春藤幼葉表面測量的F>700(紅色)和F<710(藍色)光誘導變化的比較。在1 ms下應用單周轉飽和閃光以誘導QA最大還原。重新縮放F>700響應，以獲得與F<710響應相同的O-I1相位振幅。入射光強度：7800 μmol m?2 s?1 440 nm。a O-I1平衡可變熒光產(chǎn)額的比較。b初步反褶積F（I）(黑色)和F（II）(綠色)對整個(gè)Fv>700響應(紅色)的貢獻，遵循與圖8和10中應用的相同程序，分別為小球藻和聚球藻。
本研究結果為活體內存在可變PS I熒光Fv（I）提供了有力證據，正如Lazar（2013）在生物信息學(xué)模擬基礎上提出的假設。這一證據是通過(guò)對綠藻和藍藻稀懸浮液中強光誘導的長(cháng)波和短波發(fā)射帶（F>700和F<710）熒光產(chǎn)額變化的相對簡(jiǎn)單的比較測量獲得的。F>700和F<710的多相上升動(dòng)力學(xué)的定量比較依賴(lài)于一個(gè)公認的概念，即初始O-I1上升相反映了PS-II反應中心的關(guān)閉，因此可以認為是一種特殊的F（II）反應。在標準化F>700和F<710響應中O-I1相位的振幅后，兩個(gè)信號中的所有F（II）分量應相等，而任何F（I）應導致F>700大于F<710信號。這對Fo和Fv都是適用的。我們發(fā)現，不僅Fo>700大于Fo<710，而且Fv>700大于F<710。小球藻和聚球藻在I2水平上表現出相同的誘導動(dòng)力學(xué)，但在F>700時(shí)，隨后的I2-P相振幅明顯增大。這一發(fā)現得出了I2-P含有Fv（I）的結論，小球藻的光誘導變化如圖5所示。這些結果令人印象深刻地支持了Lazar（2013）關(guān)于Fv（I）預測振幅和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的生物信息學(xué)理論預測。因此，Dusan Lazar的模擬和我們的實(shí)驗證據可以被認為是互補的，相互支持的。
Dusan Lazar和我們的結論是基于一個(gè)普遍接受的假設，即綠色植物和藻類(lèi)的熒光發(fā)射源于色素系統II或色素系統I，后者的發(fā)射在波長(cháng)>700 nm時(shí)更為明顯。當這一假設被接受時(shí)，很難找到合理的替代理論來(lái)解釋歸一化O-I1的F>700曲線(xiàn)中I2-P相的相對差異，而非接近等于F<710曲線(xiàn)。然而，由于PSⅠ受體的耗盡（在Dusan-Lazar的模擬中誘導Fv（I））以及PSⅡ熒光的增加，不能完全排除這種可能性，應該通過(guò)仔細的未來(lái)實(shí)驗進(jìn)行研究確證。PS-II熒光的這種增加不一定是由于PS-II反應中心的光化學(xué)猝滅的抑制引起的，可能是由于某種形式的非光化學(xué)猝滅的抑制引起的，必須闡明其特性。推測這種猝滅的候選物可能是氧化的PQ（Vernotte等，1979年）或具有相對低效供體側的PS II的一部分，其中氧化的酪氨酸Z和P680+在強光下積聚（Steffen等，2005年）。
Chukhutsina等（2019年）采用了一種特殊方法，在完整的葉片上應用了高度復雜的時(shí)間分辨熒光光譜法，“避免了影響熒光衰減痕跡的任何可能的光學(xué)人工干擾”，特別關(guān)注了PS I熒光的貢獻。但并未觀(guān)察到Fv（I）。在這種情況下，重要的是要認識到Fv（I）是一種瞬態(tài)現象，它會(huì )被預照光抑制。在PSⅠ抑制劑存在下，最大PSⅠ熒光不能簡(jiǎn)單地由光照誘導，類(lèi)似于在DCMU存在下Fm（II）的誘導。據我們所見(jiàn)，只有在使用可誘導重復顯示明顯I2-P相的樣品進(jìn)行測量的情況下，才有可能通過(guò)時(shí)間分辨熒光光譜法確認活體內Fv（I）的證據。在圖9和圖10的條件下對藍藻進(jìn)行測量應該不是一個(gè)太難的任務(wù)。
Schreiber教授在文章引言中表示，對于像他和Christof Klughammer這樣的儀器開(kāi)發(fā)者來(lái)說(shuō)，沒(méi)有什么比看到有能力的研究人員對我們的新設備進(jìn)行最佳利用更值得的了。有鑒于此，我們衷心感謝澳大利亞國立大學(xué)Fred Chow用PAM儀器進(jìn)行的所有精彩實(shí)驗。我們將這篇關(guān)于PS-I在體內的可變熒光的交流獻給他，希望我們的發(fā)現能幫助他發(fā)現更多復雜的光合作用拼圖中的小片段。也許現在一起尋找還不晚。