細胞活力的測定在生命科學(xué)和生物技術(shù)的許多領(lǐng)域都是必不可少的環(huán)節。傳統上，細胞活力通常通過(guò)寬視野光學(xué)顯微照片中染色細胞的半自動(dòng)或自動(dòng)計數來(lái)確定，通常這種檢測方法需要額外的染色標記過(guò)程，故很難作為在線(xiàn)或原位快速檢測的手段。Ampha Z32微流控阻抗流式細胞儀（IFC）是一種基于Coulter原理的無(wú)需標記的單細胞檢測技術(shù)，可在線(xiàn)快速、準確測定懸浮液中單細胞的活性狀態(tài)。Ampha Z32不含光學(xué)元件，無(wú)需調整和校準，便于攜帶，不僅可在實(shí)驗室使用，還同樣適用于實(shí)驗室外的檢測。此前，Ampha Z32多用于花粉質(zhì)量分析，但目前其也逐步應用到細胞生物學(xué)的許多領(lǐng)域，如檢測癌細胞的活力、分化和凋亡（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在癌細胞狀態(tài)鑒定中的應用）；監測牛紅細胞寄生蟲(chóng)感染過(guò)程；成纖維細胞分化為脂肪細胞的研究；甚至是納米材料毒性評估（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在納米材料毒性篩選中的應用）等方面。本文利用Ampha Z32精確并快速的評估了正常和熱滅活、發(fā)酵過(guò)程中以及長(cháng)期好氧間歇培養過(guò)程中酵母細胞的細胞活力和細胞狀態(tài)，并與常規染色方法進(jìn)行了比較。此外，還監測了感染桿狀病毒后昆蟲(chóng)細胞活性的變化并預測了胞內蛋白的理想收獲時(shí)間。
圖1 IFC法與PI熒光染色法測定的酵母活性的相關(guān)性A）10MHz頻率下釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活細胞（未處理；綠點(diǎn)）和死細胞（熱處理；紅點(diǎn)）的IFC相位角（x軸）-振幅（y軸）疊加散點(diǎn)圖；B）IFC法（n=3，std=0.15%）和染色法（n=3，std=4.4%）的相關(guān)性分析（R2=0.996）IFC法：本實(shí)驗中未經(jīng)處理和熱處理的酵母死細胞樣品按預定比例（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1）混合至100μl，之后用AF6緩沖液進(jìn)一步稀釋至2ml，經(jīng)20μm過(guò)濾器過(guò)濾后上機測試，三次重復，細胞采集數目設定為20000。PI法：200μl AF6和100μl 3.0μg/ml碘化丙啶（PI）稀釋100μl上述未經(jīng)處理/熱處理的細胞混合物，并使用熒光顯微鏡（Leica）計數PI染色（死亡）和未染色（存活）細胞。實(shí)驗結果表明，相較于傳統染色鏡檢法，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）操作簡(jiǎn)單、測量快速，是一種統計性、重復性、測量精度以及標準化程度都更高的檢測方法。常規培養下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化
圖2 常規培養下釀酒酵母（Scc ATCC9080）活性的變化（IFC法）
圖3. 常規培養下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化A）常規培養下，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖隨時(shí)間的變化（10 MHz）。B）酵母活性隨培養時(shí)間的變化曲線(xiàn)。C）在添加1μg/ml的兩性霉素B后的0-5h內，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖的變化釀酒酵母（Scc ATCC 9080）常規培養，即250 ml錐形瓶中在28°C的搖動(dòng)培養箱中培養數天，培養基為100 ml YPD。兩性霉素B（Sigma）處理，即將常規培養中處于指數生長(cháng)時(shí)期的釀酒酵母細胞暴露于1μg/ml的兩性霉素B中。圖2為接種培養后的第1、7和14天，釀酒酵母的相位-振幅散點(diǎn)圖的變化，從圖中可以看出，在接種培養的第7天出現兩個(gè)明顯可區分的類(lèi)群。在培養的18天中，可以清晰看到活性酵母類(lèi)群的逐漸向低相位和較小振幅移動(dòng)（圖3A），也就是說(shuō)，隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，酵母細胞活性逐漸下降（圖3B）。此過(guò)程反映了在長(cháng)期好氧間歇培養中，因營(yíng)養限制而導致的酵母細胞的死亡過(guò)程。圖3C同樣觀(guān)察到經(jīng)兩性霉素B（Sigma）處理后，釀酒酵母細胞的活性逐漸降低，但這一過(guò)程反映的是毒性化合物誘導下酵母細胞的死亡過(guò)程。這表明IFC還可應用于懸浮細胞的無(wú)標記毒理學(xué)研究，例如用于IC50值的測定。
圖4. 釀啤酒造過(guò)程中釀酒酵母活性的變化A） 開(kāi)始發(fā)酵后的前3天，酵母細胞的相位-振幅散點(diǎn)圖變化。B） 發(fā)酵過(guò)程中的酵母細胞的密度（黑色）、活力（橙色）和乙醇濃度（藍色）隨時(shí)間的變化。啤酒釀造發(fā)酵罐中的生長(cháng)條件與前面討論的情況不同，圖4記錄了酵母的發(fā)酵過(guò)程，開(kāi)始的第1天（紅色）到第2天（綠色），酵母細胞呈指數增殖，細胞濃度從5.4增加到25.3 x 106細胞/ml，細胞活力從57.1增加到83.9%（圖4B）。第3天結束時(shí)，酵母細胞（藍色）移向較低的相角，這意味著(zhù)細胞濃度的增長(cháng)減慢，細胞活力下降。而發(fā)酵罐中乙醇濃度從第一天的0.1%迅速增加到第三天的3.1%（圖4B）。這是由于培養第一天細胞濃度低、活力低且發(fā)酵罐中仍存在大量氧氣，當發(fā)酵罐中的氧氣全部消耗完后，酵母轉入厭氧乙醇發(fā)酵，乙醇濃度迅速增加，而乙醇濃度增加又會(huì )對酵母細胞產(chǎn)生毒性，故酵母細胞活性降低。IFC的檢測到的活性相位變化與以上響應過(guò)程高度一致。本文利用Ampha Z32（IFC）分別跟蹤了感染和未感染染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲(chóng)細胞培養物在首次傳代后的99h內的活力變化。
圖5 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活性的變化
圖S4 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活性相位疊加圖上圖為Sf9昆蟲(chóng)細胞在感染桿狀病毒后的數小時(shí)（hpi）內，相位-振幅散點(diǎn)圖的變化（0hpi為感染前的參考培養物）。在BV感染從0到99 hpi的整個(gè)過(guò)程中，相位-振幅散點(diǎn)圖的可明顯分離出三個(gè)細胞類(lèi)群，分為是活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類(lèi)群（圖5）。類(lèi)似于酵母（圖1），在較高的相位值（150?到220?）下分離出“活”細胞類(lèi)群。這部分活細胞在感染后的0-48hpi，阻抗振幅增加了約60%，這與感染后細胞的“膨脹”狀態(tài)相一致。阻抗振幅的變化提供了感染水平的定量讀數，可用于從病毒滴定分析中確定病毒與細胞比率（感染多重性，MOI）。48hpi后，活細胞的阻抗振幅降低（細胞萎縮）且數量逐漸減少，直至99hpi細胞全部死亡（見(jiàn)圖6）。感染晚期（LPI）細胞類(lèi)群出現在較低相位，這部分細胞在0-60hpi逐漸增加隨后減少直至消失，這是由于感染后期的細胞裂解所致。
圖S3 未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲(chóng)細胞活性的變化上圖為未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲(chóng)細胞活性的變化，同感染細胞一致，相位-振幅散點(diǎn)圖也可分離出活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類(lèi)群。如圖所示，細胞活力(97.9 %±0.7 %)在79 hpi的連續生長(cháng)過(guò)程中始終保持不變。僅當在99 hpi超過(guò)典型的繼代間隔時(shí)間時(shí)，細胞活力下降至約93.1%，這可能是由于營(yíng)養限制或細胞密度過(guò)高所致。與感染的Sf9昆蟲(chóng)細胞的相位-振幅散點(diǎn)圖（圖5）相比，未感染細胞的振幅分布（與細胞大小相關(guān)）在0-60h內略有變窄，而直到60h才明顯檢測到LPI（感染晚期）細胞類(lèi)群，到99h時(shí)該類(lèi)群略有增加。感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活力和重組蛋白表達的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化本文除利用IFC法、臺盼藍染色鏡檢法追蹤了感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活性的動(dòng)力學(xué)變化，還同時(shí)利用綠色熒光蛋轉染Sf9細胞以量化重組蛋白的產(chǎn)量，下圖為感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活力和重組蛋白表達的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化。
圖6 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞活力和重組蛋白表達的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化結果表明，在感染BV后的24hpi內，IFC法與臺盼藍成像細胞計數器的檢測結果高度一致；24-60hpi內，IFC法檢測到的活性快速下降到50%（紅實(shí)線(xiàn)），而臺盼藍成像細胞計數器檢測到的細胞活性下降緩慢，僅從100%下降到80%（藍實(shí)線(xiàn)）；從60hpi后，細胞活性均快速下降，但到99hpi時(shí)，IFC法的檢測結果僅為5%，而臺盼藍成像細胞計數器的檢測結果為42%；整個(gè)測試過(guò)程中，兩者差異在79hpi時(shí)達到最大，分別為11%和78%。79hpi的相位-振幅散點(diǎn)圖（圖5）表明此時(shí)IFC法可以準確捕捉到細胞阻抗信號發(fā)生了巨大變化（細胞的大規模重組），而臺盼藍成像細胞計數器卻不能及時(shí)檢測到這一變化。感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞大小的變化在BV感染的不同階段，細胞大小有顯著(zhù)差異。因此，臺盼藍成像細胞計數法通常用細胞大小表征BV感染的狀態(tài)和重組蛋白的產(chǎn)量質(zhì)量。如圖7所示，在23-60 hpi之間，感染細胞從最初的12.8μm膨脹到約16μm，然后在99 hpi時(shí)最終縮減到8.5μm（圖7A，紅色虛線(xiàn)）。這與IFC法獲得的平均振幅（圖7A，黑色虛線(xiàn)）的變化趨勢非常相似，分析表明，振幅數據與平均細胞大小有很好的相關(guān)性（R2=0.901）（圖7B）。也就是說(shuō)IFC法不僅可以評估細胞的活力，還可以評估細胞的大小。
圖7 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲(chóng)細胞大小的變化LPI（感染晚期）類(lèi)群大小與重組蛋白產(chǎn)量的關(guān)系相較于臺盼藍成像細胞計數法，IFC法可進(jìn)一步將失活細胞區分為感染晚期（LPI）和死細胞（dead）兩個(gè)類(lèi)群（圖5）。隨感染時(shí)間的延長(cháng)，LPI類(lèi)群的細胞在48-60 hpi內逐漸增多，到72 hpi幾乎全部消失。這一類(lèi)群的大小與裂解細胞中檢測到的表達trGFPuv的濃度相關(guān)（圖6，紅色虛線(xiàn)和黑色實(shí)線(xiàn)）。隨著(zhù)BV感染的進(jìn)一步發(fā)展，表達的trGFPuv隨細胞裂解釋放到培養基中（圖6，黑色虛線(xiàn)），其濃度的變化與IFC確定的死亡細胞總數的比例完全一致（圖6，紅色虛線(xiàn)）。盡管細胞外表達的trGFPuv的數量最終會(huì )超過(guò)細胞內的trGFPuv，但培養基中的不必要反應和裂解細胞釋放的蛋白酶可能會(huì )降低表達蛋白的質(zhì)量，因此研究者并不希望將這部分釋放的蛋白質(zhì)用于后續應用。由于IFC法檢測到的LPI群體與表達的胞內蛋白密切相關(guān)，因此利用Ampha Z32（IFC）可以很好地預測胞內蛋白的理想收獲時(shí)間。以上研究表明，Ampha Z32（IFC）微流控阻抗流式細胞儀是一種快速、可靠、無(wú)標記的細胞活力檢測技術(shù)。不僅可以在發(fā)酵過(guò)程中可靠測定細胞活力，細胞大小的變化，評估培養條件；還可以在昆蟲(chóng)細胞bv感染過(guò)程中篩選理想的表達條件、病毒滴度，預測BV昆蟲(chóng)細胞系統中獲得胞內蛋白的理想時(shí)間，可廣泛應用于微生物和動(dòng)物單細胞的培養中。
