Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）可在單細胞水平上快速表征大量細胞活性狀態(tài)。測試全過(guò)程無(wú)需使用任何標記物和染料，基于懸浮液中單細胞本身的電阻抗特性，實(shí)現對細胞活性的在線(xiàn)、高通量、快速、無(wú)損檢測。本實(shí)驗使用Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）測試了不同培養狀態(tài)下BL2細胞（起源于Burkitt淋巴瘤）的活性和濃度，并觀(guān)察了細胞凋亡過(guò)程的阻抗相位響應。
Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）核心部件是微流控芯片，當懸浮的細胞被泵入微芯片后，在外加交流電場(chǎng)作用下，不同活性狀態(tài)的細胞會(huì )產(chǎn)生不同的阻抗信號。細胞大小、細胞膜活性（離子泵）、細胞內部特性（如液泡或脂質(zhì)外殼）都會(huì )影響細胞所產(chǎn)生的阻抗信號。在變化的電場(chǎng)頻率下，儀器即可捕捉到細胞的這些特性，本儀器可以在0.3-30MHz范圍內的電場(chǎng)頻率下同時(shí)檢測4個(gè)不同頻率下細胞的電阻抗特性，如低頻（0.1-0.5MHz）和中頻（0.5-5MHz）分別捕捉有關(guān)細胞體積和細胞膜性能的信息，而更高頻率（>5MHz）中則更傾向于探測細胞內結構和細胞質(zhì)特性。
圖1 A）Ampha Z32阻抗流式細胞儀；B）微流控芯片
阻抗原始信號由實(shí)部（電阻）和虛部（容性電抗）組成（圖2B），經(jīng)信號分析后在A(yíng)mphaSoft軟件中以相位-振幅散點(diǎn)圖的形式輸出（圖3）。散點(diǎn)圖上每個(gè)數據點(diǎn)對應一個(gè)測細胞的阻抗響應。根據樣品細胞濃度的不同，每秒可以分析數百到上千個(gè)細胞。
圖2 BL2細胞的阻抗信號
A) 每秒的原始信號。每個(gè)振幅對應于細胞通過(guò)微流控芯片電場(chǎng)時(shí)的信號。B) 部分原始信號的放大，顯示了兩個(gè)活細胞和一個(gè)死細胞的阻抗響應。原始信號由實(shí)部（藍線(xiàn)）和虛部（綠線(xiàn)）組成。通過(guò)識別實(shí)部和虛部信號的峰值，換算成每個(gè)細胞的相位角和振幅。
AmphaSoft軟件可直觀(guān)的輸出每個(gè)測試樣品的相位-振幅散點(diǎn)圖，并進(jìn)行活性-失活類(lèi)群分析、不同樣品的疊加分析以及選定類(lèi)群的統計分析，并可以.CSV，.HTML及.PNG格式輸出綜合報告和結果。此外，針對不同樣品的測試模板方便用于同系列和同類(lèi)型樣品的重復測量和比較。
圖3 BL2的相位-振幅散點(diǎn)圖
如圖3所示，在10 MHz測量頻率下，該培養狀態(tài)的BL2細胞的活性為83.37%。相位-振幅散點(diǎn)圖的頂部和右側分別顯示了相位直方圖和振幅直方圖。當使用多個(gè)頻率測量細胞時(shí)，AmphaSoft軟件可在同一個(gè)界面輸出每個(gè)頻率的測量結果，直觀(guān)對比細胞對不同頻率的阻抗響應。上圖散點(diǎn)圖中的左側類(lèi)群對應于死細胞，而右側類(lèi)群對應于活細胞。顏色差異顯示了細胞的密集程度。
Ampha Z32的測試流程
Ampha Z32測量過(guò)程無(wú)需對細胞進(jìn)行染色標記，且樣品的使用量很小。測量前只需經(jīng)過(guò)稀釋、添加測量緩沖液和過(guò)濾三個(gè)步驟。
（一）從細胞培養液中取樣，通常僅需50–100μl；
（二）根據細胞類(lèi)型和應用，選取合適的測量緩沖液稀釋樣品；
對于BL2細胞而言，使用AF6測量緩沖液。通常，如果直接從培養液中提取樣品，則建議在1:1到1:10之間稀釋。
（三）過(guò)濾以去除顆粒團塊；此步驟取決于細胞培養物的大小、純度以及顆粒與芯片通道橫截面的比率。
對于BL2細胞，不需要過(guò)濾步驟。
（四）上樣測量；測試過(guò)程全自動(dòng)，并在達到某個(gè)設定停止條件（時(shí)間、細胞數量、體積）或用戶(hù)手動(dòng)停止測量時(shí)結束。
不同培養時(shí)期BL2細胞的活力
活的和失活的BL2細胞的阻抗信號有明顯的差異（圖2B）。在相位-振幅點(diǎn)圖中，兩者歸屬于不同的散點(diǎn)云類(lèi)群。失活細胞在低阻抗相位角形成一個(gè)封閉的云群，而活細胞通常在高阻抗相位角形成一個(gè)分布更廣泛的云群。對處于不同培養時(shí)期的細胞，隨著(zhù)細胞開(kāi)始凋亡和死亡，活細胞云群的相位角逐漸減小。
圖4 不同培養時(shí)期BL2細胞的活力分析
圖5 不同培養時(shí)期BL2細胞的阻抗相位和細胞活力的變化
圖5顯示BL2細胞在培養的0、1、2和6天內阻抗相位和細胞活力的變化。從圖中可以看到，在第1天之后，BL2活細胞群發(fā)生明顯相移且細胞活力的急劇下降。
BL2細胞濃度
除了細胞活力之外，Ampha Z32阻抗流式細胞儀還可準確測量BL2的總細胞數、活細胞和死細胞濃度。為了確定濃度的線(xiàn)性測量范圍，本實(shí)驗制備了一系列稀釋液。
● 以1,500rpm的轉速將細胞離心2分鐘來(lái)收集BL2細胞樣品，然后棄去上清液并用新鮮的測量緩沖液重新懸浮細胞。
● 之后按1:3、1:9和 1:27稀釋濃度制備稀釋液，并重復測量三次。
● 使用Neubauer計數板對1:3稀釋液進(jìn)行定量。
一系列稀釋液的測量結果顯示如圖6A所示，兩種檢測方法的計數結果顯示出高度的線(xiàn)性一致性。然而高濃度細胞（> 2×106個(gè)cells/ml）會(huì )導致Ampha Z32的阻抗信號重疊，這是由于高濃度下，多個(gè)細胞容易緊密通過(guò)或重合通過(guò)微流控芯片（圖5C），這將導致細胞濃度被低估。此時(shí)可使用測量緩沖液調整稀釋倍數，使樣品濃度達到合適的測定范圍。圖5B中的結果表明Ampha Z32活力測定結果的可重復性極高，且不受細胞濃度影響。
圖6 Ampha Z32測試的合理濃度范圍
A) IFC法與Neubauer計數板的相關(guān)性分析（n=3，sd=±3%）；B) 不同稀釋倍數下的細胞活力，細胞活力不受細胞濃度的影響（非配對t檢驗，p>0.05）;C) 原始樣品和按1:27稀釋后，細胞阻抗信號示例（2MHz頻率下）。高濃度原始樣本出現干擾信號（最左邊的信號）和雙峰信號（虛線(xiàn)框），這是由于細胞緊密通過(guò)或重合通過(guò)微流控芯片。相比之下，1:27稀釋后的樣品具有更明顯和離散的粒子信號。
BL2細胞的凋亡過(guò)程
Staurosporine是一種蛋白激酶抑制劑和細胞凋亡誘導劑。圖7顯示在Staurosporine誘導下，BL2活細胞群的阻抗信號變化（相移），直到細胞全部死亡。
從該誘導過(guò)程（圖7）以及培養過(guò)程（圖4A）中細胞阻抗信號的變化可以發(fā)現，在整個(gè)細胞凋亡過(guò)程中，細胞從高相位角（≈325°，活細胞和增殖細胞）經(jīng)中間過(guò)渡狀態(tài)（細胞凋亡）到低相位角（≈235°，死細胞）。因此，相位角可以作為指示細胞狀態(tài)的一個(gè)有效指標。
圖7 Staurosporine誘導下BL2細胞的凋亡過(guò)程
A）Staurosporine誘導后，BL2細胞相位直方圖隨時(shí)間的變化?；罴毎涸谡T導初期(t<10min)快速發(fā)生相移，之后穩步發(fā)生變化，直到細胞開(kāi)始死亡(t>1.5h)。該相位直方圖10MHz電場(chǎng)頻率下獲得。B）Staurosporine誘導的50個(gè)小時(shí)內，BL2細胞活力的變化過(guò)程。從圖中可以看出，接觸Staurosporine誘導1.5h后，BL2細胞的活力迅速下降，此時(shí)對照組（DMSO誘導）BL2細胞仍處于生長(cháng)狀態(tài)。18h后，對照組BL2細胞活力才開(kāi)始降低。
結論
本次實(shí)驗結果表明，Ampha Z32阻抗流式細胞儀是一種在單細胞水平上測量細胞電特性的強大的無(wú)標記檢測方法，并可以>1,000個(gè)Cells/s的采集速率實(shí)現細胞的高通量檢測。每個(gè)細胞的測量阻抗數據實(shí)時(shí)顯示在相位-振幅散點(diǎn)圖中，測量結束后可以快速識別和量化活細胞和死細胞，并獲得各自的細胞濃度。此外，根據阻抗相位的變化還可準確預判細胞狀態(tài)，即細胞的存活、凋亡或死亡。
因此，我們認為Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）是一種可以無(wú)標記、快速表征細胞狀態(tài)的檢測技術(shù)，在監測細胞培養物的濃度和活力、對凋亡誘導劑、細胞毒劑或其他試劑的劑量反應或反映進(jìn)程中有著(zhù)廣闊的應用前景。
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