摘 要
本研究以衰老綠蘿（Epipremnum aureum）葉片為材料，通過(guò)Dual-PAM/F熒光儀同步測定葉綠素熒光和P700?吸收信號，發(fā)現衰老葉片在照光后穩態(tài)熒光（Fs）出現顯著(zhù)低于暗適應初始熒光（Fo）的“超淬滅”現象，且幅度與最大熒光（Fm）相當。對比健康金魚(yú)吊蘭（Nematanthus wettsteinii）葉片的熒光動(dòng)態(tài)，結合熒光參數分析表明：衰老綠蘿葉片的超淬滅與非光化學(xué)猝滅（NPQ）的異常增強、光化學(xué)效率（Y(II)）的顯著(zhù)下降及受體側限制（Y(NA)）的升高密切相關(guān)。機制上，這一現象可能源于衰老過(guò)程中光合機構解體引發(fā)的高效熱耗散機制、狀態(tài)轉換的過(guò)度激活、PSⅡ反應中心氧化態(tài)（P680?）的異常積累，以及葉綠體降解產(chǎn)生的新型淬滅劑作用。本研究為理解葉片衰老過(guò)程中光合機構的應激調控提供了新視角。
關(guān)鍵詞：葉綠素熒光；超淬滅；植物衰老
Abstract
In this study, using senescent leaves of Epipremnum aureum as materials, chlorophyll fluorescence and P700? absorption signals were simultaneously measured by a Dual-PAM/F fluorometer. It was found that the steady-state fluorescence (Fs) of senescent leaves after illumination showed a "superquenching" phenomenon, which was significantly lower than the dark-adapted initial fluorescence (Fo), with an amplitude comparable to the maximum fluorescence (Fm). By comparing the fluorescence dynamics of healthy leaves of Nematanthus wettsteinii and combining with fluorescence parameter analysis, it was indicated that the superquenching in senescent Epipremnum aureum leaves was closely related to the abnormal enhancement of non-photochemical quenching (NPQ), the significant decrease in photochemical efficiency (Y(II)), and the increase in acceptor-side limitation (Y(NA)). Mechanistically, this phenomenon may result from efficient heat dissipation mechanisms induced by the disintegration of photosynthetic apparatus during senescence, overactivation of state transitions, abnormal accumulation of the oxidized state of PSⅡ reaction centers (P680?), and the action of new quenchers produced by chloroplast degradation. This study provides a new perspective for understanding the stress regulation of photosynthetic apparatus during leaf senescence.
Key words: Chlorophyll fluorescence; Super quenching; Plant Senescence
引 言
葉綠素熒光分析是揭示光合機構功能狀態(tài)的有效工具，其中暗適應初始熒光（Fo）反映PSⅡ反應中心完全開(kāi)放時(shí)的基礎熒光，穩態(tài)熒光（Fs）則代表光適應下的熒光水平，通常介于Fo與最大熒光（Fm）之間（Schreiber et al., 1998）。近年來(lái)，部分研究發(fā)現脅迫或衰老葉片中Fs可能低于Fo（Flexas et al., 2002；Belyaeva et al., 2019），但該“超淬滅”現象的機制尚未明確。
葉片衰老伴隨葉綠素降解、PSⅡ反應中心損傷及碳同化能力下降（Lim et al., 2007），可能導致過(guò)剩光能積累，進(jìn)而激活非光化學(xué)淬滅（NPQ）等保護機制（Demmig-Adams & Adams, 1992）。此前研究表明，衰老葉片的NPQ可能異常增強（Guo et al., 2018），但NPQ是否足以解釋Fs遠低于Fo的極端現象仍存爭議。此外，我們推測光合機構解體可能產(chǎn)生新型淬滅劑（如游離葉綠素或變性蛋白），或PSⅡ反應中心氧化態(tài)（P680?）的壽命延長(cháng)，均可能參與超淬滅。
本研究以衰老綠蘿葉片為對象，結合健康金魚(yú)吊蘭葉片作為對照，通過(guò)同步分析葉綠素熒光和P700?信號，揭示Fs超淬滅現象的特征及潛在機制，為葉片衰老的光合調控研究提供理論依據。
材料與方法
1. 植物材料與生長(cháng)條件
選取室內自然光環(huán)境中生長(cháng)的綠蘿（Epipremnum aureum）早期衰老葉片（葉片發(fā)黃，Fv/Fm≈0.341）和室內靠窗位置生長(cháng)的金魚(yú)吊蘭（Nematanthus wettsteinii）健康葉片（每日受約1000 μmol·m?2·s?1光照，Fv/Fm≈0.827）。光照強度由ULM-500手持式PAR輻射儀（Heinz WALZ, GmbH）測定。
2. 葉綠素熒光與P700?吸收測量
采用Dual-PAM/F光纖版雙通道葉綠素熒光儀（Heinz WALZ, GmbH）同步測量葉綠素熒光與P700?吸收信號。葉片暗適應20分鐘后進(jìn)行光誘導與暗馳豫測量。綠蘿葉片采用60 μmol·m?2·s?1光化光照射，記錄熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)并監測暗馳豫；金魚(yú)吊蘭葉片采用750 μmol·m?2·s?1光化光照射，其余條件相同。通過(guò)Dual-PAM軟件計算Fo、Fs、Fm、Fv/Fm、Y(II)、qP、NPQ以及P700?吸收等參數，并將所有熒光與P700曲線(xiàn)分別以Fo、Fm和Po、Pm歸一化處理。
3. 數據處理
采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數據整理和圖形繪制。
結果與分析
1. 葉綠素熒光和P700+誘導動(dòng)力學(xué)
如圖1所示，綠蘿衰老葉片與金魚(yú)吊蘭健康葉片在照光初期的熒光動(dòng)力學(xué)存在較大差異。在綠蘿衰老葉片中，照光后Fs快速下降，并顯著(zhù)低于暗適應初始熒光Fo，其最低值約達到歸一化后-Fm的水平。暗馳豫過(guò)程中，Fs逐漸回升，但在觀(guān)察時(shí)間內仍未恢復至Fo水平。相比之下，金魚(yú)吊蘭健康葉片的Fs始終介于Fo與Fm之間，基本未出現超過(guò)Fo的下降，僅在暗馳豫初期出現短暫且幅度很小的下降。這些結果表明，衰老葉片存在明顯的Fs超淬滅現象，其幅度遠大于健康葉片的正常淬滅行為。P700?吸收動(dòng)力學(xué)可以看出，光下綠蘿衰老葉片低于金魚(yú)吊蘭健康葉片，表明其電子傳遞鏈處于相對還原狀態(tài)。
圖1 葉綠素熒光與P700?誘導動(dòng)力學(xué)及暗馳預曲線(xiàn)。上圖為葉綠素熒光信號，紅色曲線(xiàn)為綠蘿早期衰老葉片，Fv/Fm為0.341，使用60μmol·m?2·s?1的光化光測量；黑色曲線(xiàn)為金色吊籃健康葉片，Fv/Fm為0.827，使用750μmol·m?2·s?1的光化光測量。兩條曲線(xiàn)均以Fo，Fm和Po，Pm進(jìn)行歸一化。下圖為同步記錄的P700?信號。
2. 熒光參數對比
進(jìn)一步分析熒光參數可揭示超淬滅背后的能量分配特征（圖2）。首先，PSII方面，最大光化學(xué)效率Fv/Fm和實(shí)際光化學(xué)效率Y(II)在衰老葉片中顯著(zhù)降低。即便在弱光下，衰老綠蘿葉片的Y(II)在照光過(guò)程中持續較低，平均值約為0.06±0.03，而金魚(yú)吊蘭葉片平均為0.16±0.05，表明前者PSII反應中心的結構與功能均嚴重受損。盡管Y(II)較低，衰老綠蘿葉片的光化學(xué)猝滅系數qP和qL卻保持較高水平（均值約0.35±0.04），明顯高于金魚(yú)吊蘭（0.15±0.03），表明衰老葉片PSII反應中心仍維持較高的開(kāi)放比例。這意味著(zhù)衰老葉片吸收的光能無(wú)法通過(guò)正常光化學(xué)反應消耗，而是以其他形式耗散。PSI方面，衰老葉片的Y(ND)（供體側限制）較低，但Y(NA)（受體側限制）較高，提示受體側也就是暗反應的電子利用能力可能是衰老葉片光合作用的主要限制因素。
在非光化學(xué)淬滅方面，衰老綠蘿葉片表現出極高的NPQ和Y(NPQ)。弱光（60 μmol·m?2·s?1）照射便能誘導綠蘿葉片出現顯著(zhù)NPQ峰值（約2.028），而金魚(yú)吊蘭葉片NPQ在強光750 μmol·m?2·s?1下才達到類(lèi)似水平。這表明衰老葉片中的熱耗散機制極度活躍，弱光便可高度激活。綜合而言，衰老葉片吸收的光能主要通過(guò)NPQ強力耗散，而光化學(xué)轉化大幅削弱。
上述現象表明，綠蘿衰老葉片處于一種極度不平衡的能量分配狀態(tài)：PSII中心大量開(kāi)放（高qP）但光化學(xué)效率低下（低Y(II)），過(guò)剩的激發(fā)能被迫通過(guò)NPQ通路迅速散逸，導致Fs下降到Fo以下。同時(shí)，PSI方面衰老葉片的Y(NA)（受體側限制）升高，暗示PSI受體側電子傳遞受阻，這也可能加劇了電子傳遞鏈的還原態(tài)?？傊?，綠蘿衰老葉片的PSII功能受損，PSI受體側功能受損更嚴重，但維持了非光化學(xué)淬滅等光保護機制高效運轉。實(shí)驗結果明確了衰老葉片中Fs超淬滅現象與較強的非光化學(xué)淬滅和較低的光化學(xué)效率密切相關(guān)。
討 論
1. 衰老綠蘿葉片Fs超淬滅的特征與特殊性
本研究發(fā)現，衰老綠蘿葉片的Fs超淬滅具有以下特征：（1）幅度極端（達-Fm水平），遠超健康葉片的常規淬滅；（2）對弱光敏感，在60μmolm?2s?1光強下即可誘導；（3）伴隨NPQ的快速激活與恢復。這些特征與裸子植物的輕度淬滅及健康葉片的光化學(xué)淬滅（Flexas et al., 2002）存在本質(zhì)差異，表明衰老綠蘿葉片可能啟動(dòng)了特殊的淬滅機制。
2. 超淬滅現象的潛在機制
（1）非光化學(xué)淬滅（NPQ）的異常增強
綠蘿衰老葉片的NPQ在弱光下即達強光水平，且Y(NPQ)升高，表明調節性熱耗散（如葉黃素循環(huán)）過(guò)度激活。衰老導致碳同化能力下降，電子傳遞鏈受阻使類(lèi)囊體腔酸化（ΔpH升高），觸發(fā)紫黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)轉化，增強天線(xiàn)色素的熱耗散（Gilmore, 1997）。這與光合能力下降背景下光保護機制代償性增強的假設一致。
（2）狀態(tài)轉換機制
狀態(tài)轉換作為光合機構平衡光系統Ⅰ（PSI）與光系統Ⅱ（PSⅡ）激發(fā)能分配的關(guān)鍵調節機制，可能在衰老葉片的超淬滅中發(fā)揮作用。在藍細菌（如Synechocystis sp. PCC 6803）中，狀態(tài)轉換通過(guò)藻膽體（PBS）的移動(dòng)或與光系統的結合狀態(tài)改變實(shí)現：當PSⅡ激發(fā)過(guò)剩時(shí)，PBS從PSⅡ解離并優(yōu)先結合PSI（狀態(tài)2），減少PSⅡ的激發(fā)能輸入導致Fs降低（Calzadilla & Kirilovsky, 2020；Pfennig et al., 2024）。這種調節依賴(lài)質(zhì)體醌（PQ）庫的還原狀態(tài)——衰老葉片中電子傳遞鏈受阻導致PQ過(guò)度還原，可能異常激活狀態(tài)轉換，促使更多天線(xiàn)色素與PSI結合，直接降低PSⅡ的熒光產(chǎn)量（Fs）。
本研究中，衰老綠蘿葉片的PSI受體側限制（Y(NA)）升高，暗示PSI電子傳遞受阻，可能反饋增強狀態(tài)轉換向狀態(tài)2的傾斜。結合藍細菌的模型（Pfennig et al., 2024），這種傾斜會(huì )通過(guò)兩個(gè)途徑加劇超淬滅：一是PSⅡ天線(xiàn)色素減少導致基礎熒光（Fo）貢獻降低；二是PSI結合的天線(xiàn)色素通過(guò)非光化學(xué)途徑（如葉黃素循環(huán)協(xié)同作用）強化熱耗散，使Fs進(jìn)一步低于Fo。此外，衰老葉片中高qP與低Y(II)的矛盾，可能與狀態(tài)轉換導致的PSⅡ反應中心“空開(kāi)放”（即開(kāi)放但無(wú)有效光化學(xué)轉化）相關(guān)，這些中心成為激發(fā)能淬滅的額外位點(diǎn)，進(jìn)一步壓低熒光信號。
因此，狀態(tài)轉換的異常激活可能是衰老葉片超淬滅的重要補充機制，其與NPQ、P680?積累的協(xié)同作用，共同導致了Fs的極端下降。
（3）PSⅡ反應中心氧化態(tài)（P680?）的積累
盡管P680?壽命通常較短（微秒級），但衰老葉片中PSⅡ修復機制（如D1蛋白合成）受損，可能導致P680?還原受阻、壽命延長(cháng)（Melis, 1999）。P680?作為強淬滅劑，可通過(guò)非輻射能量轉移壓低熒光信號，與衰老綠蘿葉片高qP（反應中心開(kāi)放）但低Y(II)（光化學(xué)效率低）的矛盾現象一致——開(kāi)放的反應中心可能因P680?積累而無(wú)法有效利用光能。
（4）葉綠體降解產(chǎn)生的新型淬滅劑
衰老伴隨葉綠體結構解體，釋放游離葉綠素、變性蛋白或膜碎片，這些物質(zhì)可能形成高效淬滅復合體。例如，游離葉綠素與蛋白的非特異性結合可增強激發(fā)能的熱耗散（Horton et al., 1996），這可能是綠蘿葉片超淬滅幅度極端的關(guān)鍵原因。此外，綠蘿葉片Y(NA)升高提示PSI受體側受限，過(guò)剩電子可能引發(fā)活性氧積累，進(jìn)一步加劇光合機構降解與淬滅劑釋放。
3. 生理意義：衰老葉片的應急能量卸載策略
衰老葉片在光合能力嚴重下降（Fv/Fm=0.341）的情況下，通過(guò)超淬滅快速卸載過(guò)剩光能，可能是避免光損傷的最后防御機制。高qP表明反應中心仍保持開(kāi)放，但其功能已從光化學(xué)轉化轉向能量耗散，這種功能性冗余可能延長(cháng)衰老葉片的存活時(shí)間，為營(yíng)養回收爭取時(shí)間（Lim et al., 2007）。
研究展望
未來(lái)研究可從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步探究衰老葉片超淬滅的本質(zhì)：首先，需要結合分子遺傳和代謝組學(xué)手段，明確葉綠體解體過(guò)程中釋放物質(zhì)（游離葉綠素、變性蛋白等）對淬滅的貢獻。其次，深入研究超淬滅現象的適應價(jià)值，比較不同環(huán)境條件（光強、溫度、干旱等）和不同物種衰老葉片中超淬滅發(fā)生的差異，以揭示其生態(tài)意義。此外，可應用高時(shí)間分辨率葉綠素熒光分析等新技術(shù)（如Multi-Color-PAM-II），更精確地表征衰老葉片中非光化學(xué)猝滅成分及能量分布的動(dòng)態(tài)變化。最后，應構建數學(xué)模型，將光合電子傳遞、質(zhì)子流和熱耗散等因素整合模擬，以量化各種機制對超淬滅的影響。這些研究有助于系統完善超淬滅的理論框架，指導作物栽培中管理衰老葉片光環(huán)境，從而提高作物抗逆性和光合效率。
結 論
本研究在衰老綠蘿葉片和金魚(yú)吊蘭健康葉片中比較發(fā)現：衰老葉片在照光誘導下Fs迅速降低并遠低于Fo，表現為明顯的超淬滅現象。衰老葉片同步伴有NPQ異常增強、PSII光化學(xué)效率下降、反應中心高開(kāi)放和PSI受體側限制升高等特征。推測超淬滅現象主要源于衰老過(guò)程中葉綠體光合機構功能退化和保護機制的共同作用：一方面強烈的葉黃素循環(huán)驅動(dòng)NPQ將大量光能耗散（高qE），結合狀態(tài)轉換機制的過(guò)度激活減少了PSII激發(fā)能的輸入，另一方面PSII中心P680?積累和葉綠體降解產(chǎn)物的出現提供了新型淬滅途徑。這一現象可能代表衰老葉片在光合能力衰退背景下的緊急能量卸載策略，有助于避免光損傷并延緩葉片衰亡?？傊?，葉綠素熒光超淬滅可能是衰老葉片光合機構退化與保護性調控共同作用的結果，未來(lái)應進(jìn)一步結合分子層面探究其具體機制及生態(tài)意義。
參考文獻
郭峰：上海澤泉科技股份有限公司，feng.guo@zealquest.com
