孢子萌發(fā)對于細菌定殖是必要的第一步，孢子在結腸中的萌發(fā)速率依賴(lài)于宿主菌群的組成，宿主菌群可調控初級及次級膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發(fā)。Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了一項最新研究，基于萌發(fā)的孢子有著(zhù)更高的凈電導率這一特征，開(kāi)發(fā)了一種基于阻抗檢測的高通量單細胞計數法（Ampha Z32阻抗流式細胞儀，瑞士Amphasys），僅需4小時(shí)（傳統方法需24小時(shí)）即可評估艱難梭菌的孢子萌發(fā)情況，并可用于評估宿主菌群對艱難梭菌感染的易感性。
① 利用高通量單細胞阻抗計數法（>300 events/s）對活細菌細胞進(jìn)行定量；
② 相比于傳統的菌落分析方法（需24h），該方法僅需培養4h即可評估孢子萌發(fā)情況，檢測下限為每50μL樣本中約100個(gè)活細胞；
③ 萌發(fā)的艱難梭菌孢子有更高的凈電導率，這在中等導電介質(zhì)（0.8S/m）內造成了獨特的高頻（10 MHz）阻抗相分散（活細胞與失活細胞離散）；
④ 該方法可對比在不同的初級膽鹽水平下的艱難梭菌孢子萌發(fā)速率，并可用于評估宿主對艱難梭菌感染的易感性。
圖1（a） 艱難梭菌孢子萌發(fā)到其營(yíng)養體形式受到“正?！本褐泄采毦囊种?，該菌群分泌水解酶，能夠代謝初級膽鹽為次級膽鹽，而缺乏共生細菌的抗生素破壞菌群表現出較高的初級至次級膽鹽水平，導致孢子萌發(fā)增強；（b） 整體實(shí)驗時(shí)間表：包括孢子預處理、細菌生長(cháng)、IFC（阻抗流式細胞儀）微流控表型分析和菌群驗證；（c）阻抗式細胞儀分析的具體樣品制備步驟；（d） 來(lái)自抗生素處理的小鼠模型的宿主菌群樣本的采集、制備和分析步驟。圖2 艱難梭菌UK1孢子在不同水平?；悄懰猁}的標準生長(cháng)培養基中培養后的微生物學(xué)分析圖2（a） 24小時(shí)內的生長(cháng)曲線(xiàn)顯示，隨著(zhù)?；悄懰猁}水平的增加，孢子萌發(fā)率逐漸提高，由于營(yíng)養性艱難梭菌的存在， 0.001% 、0.01%和 0.1%?；悄懰猁}水平下的吸光度分別在20h、18h、15h（用虛線(xiàn)標記）與無(wú)?；悄懰猁}的對照組的吸光度相比，出現顯著(zhù)差異（*p<0.05）；（b） 24小時(shí)后的CFU分析結果顯示，含有0.1%?；悄懰猁}的生長(cháng)培養基的孢子萌發(fā)顯著(zhù)（****p<0.0001），而其他?；悄懰猁}水平下孢子萌發(fā)并不明顯；（c）培養4小時(shí)后的DEP歸一化光譜和頻譜結果顯示，含有0.1%?；悄懰猁}的DEP歸一化光譜與同質(zhì)營(yíng)養體艱難梭菌勻質(zhì)樣品的DEP歸一化光譜（實(shí)線(xiàn)）極為相似，根據異質(zhì)樣本的凈電生理特性可以推斷，在0.1%?；悄懰崽幚淼臉颖局写嬖跔I(yíng)養體艱難梭菌亞群，這與傳統法分析（圖2a和b）的評估結果一致，但檢測可在更短時(shí)間內進(jìn)行（4小時(shí).VS >15小時(shí)）。圖3 營(yíng)養體艱難梭菌細胞和孢子的多殼層介電模型&均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜
圖3（a） 基于營(yíng)養體細胞和孢子的大小、形狀和結構差異，生成多殼層介電模型；（b） 營(yíng)養體細胞和孢子均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜結果表明，不同樣品類(lèi)型的極化和電生理特性存在明顯差異。低于100 kHz的電場(chǎng)頻率下，營(yíng)養體艱難梭菌細胞因絕緣細胞外殼表現為nDEP（負DEP），但在高于1 MHz的電場(chǎng)頻率下，營(yíng)養體艱難梭菌因細胞內部的導電細胞質(zhì)而發(fā)生極化，表現出pDEP（正DEP）。圖4 不同頻率、介質(zhì)電導率下，艱難梭菌活細胞營(yíng)養體與熱滅活后的艱難梭菌細胞的阻抗數據（相位-振幅）疊加圖（IFC法）由于孢子萌發(fā)過(guò)程中樣品的異質(zhì)性，研究可利用Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC法）通過(guò)檢測營(yíng)養體艱難梭菌的電生理學(xué)特征來(lái)鑒定孢子萌發(fā)，并量化營(yíng)養體艱難梭菌的比例。圖4為不同頻率（0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f)）、不同介質(zhì)導電條件（0.5× PBS（a-c）、1× PBS（d–f) ）下，艱難梭菌活細胞營(yíng)養體與熱滅活后的艱難梭菌細胞的阻抗數據（相位-振幅）疊加圖。對比可知，0.5× PBS（介質(zhì)電導率為 0.8 S/m），10 MHz 下二者的區分度最佳，篩選門(mén)控可設于218°相位處（圖4c實(shí)線(xiàn)），此時(shí)艱難梭菌活細胞占比＞95%。圖5 不同?；悄懰猁}水平、不同培養時(shí)間下艱難梭菌活細胞的占比（IFC法：0.5× PBS，10 MHz）圖5顯示孢子萌發(fā)率隨生長(cháng)培養基中?；悄懰猁}水平以及萌發(fā)時(shí)間的增加而增加，其中0.1% ?；悄懰猁}的生長(cháng)培養基中培養 4 小時(shí)后，孢子萌發(fā)率約為 30%（每50μL 樣品約 250 個(gè)營(yíng)養體艱難梭菌細胞），而0.05–0.1%?；悄懰猁}的生長(cháng)培養基中萌發(fā) 5 小時(shí)后，孢子的萌發(fā)率可達80%以上；該測定結果表明艱難梭菌對培養時(shí)間和生長(cháng)培養基中初級膽汁鹽（?；悄懰猁}）比例的變化表現出良好的敏感性。圖6 未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)實(shí)驗比較（宿主菌體外菌群）本研究使用從小鼠模型獲得的體外菌群樣品進(jìn)一步驗證了實(shí)驗結果的可靠性。在使用克林霉素進(jìn)行抗生素治療10天后，按照圖1d的步驟進(jìn)行了艱難梭菌孢子萌發(fā)實(shí)驗。CFU分析（圖6a）結果顯示，未經(jīng)處理的菌群的孢子發(fā)芽率明顯較低，而克林霉素處理的菌群培養24小時(shí)后，孢子萌發(fā)水平顯著(zhù)提高（**p<0.01），表明抗生素處理后菌群多樣性的減少可能會(huì )提高艱難梭菌的萌發(fā)率，這與此前的研究結果一致。而使用阻抗流式細胞儀（IFC法）在培養4小時(shí)后即可檢測出未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)率（***p<0.001，圖6b）和孢子數量（**p<0.01，圖6c）上的顯著(zhù)差異。這表明與CFU法相比，IFC法具有更高的靈敏性，可以更早檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異（4h與 24 h）。綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC法）可用于識別艱難梭菌營(yíng)養體，量化宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)率的影響，并在較短時(shí)間內檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異。該方法檢測靈敏度高、測量快速、樣品制備簡(jiǎn)單，有潛力進(jìn)一步用于CDI臨床測量的基準測試，調查抗生素治療下腸道菌群隨時(shí)間變化的敏感性差異，并通過(guò)初始和復發(fā)艱難梭菌感染的易感性指導臨床管理決策。John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
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